2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Việc thu mẫu rong biển ở vùng triều dựa vào “Quy trình Điều tra Tài nguyên và Mơi trường biển- Phần Sinh học và Hĩa Mơi trường” [78]. Khảo sát vùng dưới triều dựa vào tài liệu hướng dẫn của Wilkinson và Baker [79] bằng thiết bị lặn SCUBA, máy chụp ảnh dưới nước kĩ thuật số hiệu OLYMPUS (sản xuất tại Nhật Bản).
Mẫu bảo quản hoặc làm tiêu bản sau khi thu, được ngâm trong dung dịch formol 5%. Mẫu khơ (tiêu bản) được đặt trên giấy croki sau đĩ ép trong giấy thấm.
Mẫu nghiên cứu hĩa - sinh, sau khi thu (khoảng 2 kg tươi) được rửa sạch bằng nước biển sau đĩ rửa bằng nước ngọt và bảo quản ngay trong nhiệt độ 4OC (ngồi thực địa bảo quản bằng túi bảo quản lạnh hoặc đá khơ, trong phịng thí nghiệm bằng tủ đơng SANAKY sau đĩ bảo quản bằng tủ lạnh sâu ở -20OC và -47OC).
Mẫu định loại được phân tích trong phịng thí nghiệm của Phịng Sinh thái và Tài nguyên Thực vật biển (Viện Tài nguyên và Mơi trường biển - Hải Phịng).
2.2.2. Phương pháp phân lập, chiết tách lipid, axit béo
2.2.2.1. Phương pháp chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng
Chiết lipid tổng theo phương pháp của E.G. Bligh và W.J. Dyer [80] đã được cải tiến kết hợp với siêu âm, phương pháp được sử dụng thường quy cho mẫu rong biển tại phịng thí nghiệm của Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên.
Tách lớp màu trong lipid tổng: dùng sắc kí cột áp suất thường (CC), được
tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường với cỡ hạt là 0,040 - 0,063mm (240- 430 mesh).
2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng trong lipid tổng
Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid được phân tích và xác định trên bản mỏng tráng sẵn Sorbfil (6cm × 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga) theo Imbs A. B. năm 2015 [81]. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sĩng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bề mặt bản mỏng, sấy khơ nĩng trên bếp điện từ cho đến khi hiện màu. Scan bản mỏng trên máy Epson perfection 2400 PHOTO với thang màu xám, độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn. Định lượng các lớp chất trong lipid tổng được xác định dựa trên sự đo
diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga.
2.2.2.3. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các axit béo
Xác định thành phần, hàm lượng các axit béo bằng sắc kí khí (GC, GC-MS). Các axit béo trong lipid tổng được metyl hố sang dạng methyl ester bằng tác nhân H2SO4 2%/MeOH theo phương pháp của Carreau & Dubacq (1978) [82] sau đĩ xác định thành phần và hàm lượng các axit béo theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998 [83], phân tích trên máy sắc kí khí GC và GC-MS. Máy sắc ký khí (GC) hãng Shimadzu GC-2010 (Kyoto, Nhật Bản) sử dụng detector ion hĩa ngọn lửa (FID) trên cột mao quản Equity 5 (Merck, L ì ID 30m ì 0,25mm, df 0,25àm). Mỏy sắc ký khí kết nối khối phổ (GC-MS) hãng Shimadzu GCMS QP5050A (Kyoto, Nhật Bản). Chương trình chạy GC và GC-MS được thực hiện ở 160oC đến 240oC, tăng 2oC/phút và giữ ở nhiệt độ 240oC trong thời gian 20 phút. Nhiệt độ injector và detector là 250oC, khí mang là He với tốc độ 20 ml/phút.
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu tử chính
Phương pháp phân tích cấu tử chính (Principal Component Analysis - PCA) được sử dụng để xử lý các số liệu nhiều chiều về thành phần các axit béo của các mẫu rong biển, đưa chúng về các hệ tọa độ đơn giản hơn, trực quan hơn nhằm tìm ra các mối tương quan của chúng với nhau. Các kết quả thu được cho phép ta tìm ra các mẫu cĩ mối liên hệ gần gũi, hay đối lập, hay tách biệt, trên cơ sở đĩ chia chúng thành các nhĩm cĩ các đặc điểm chung. Phần mềm SAS-JMP Statistical discovery Pro 13:2:1 69 được sử dụng để phân tích cấu tử chính và xử lý số liệu sàng lọc [84].
2.2.4. Phương pháp xác định các dạng phân tử lipid phân cực
Việc xác định hàm lượng và cấu trúc các dạng phân tử được thực hiện theo phương pháp của Imbs cùng cộng sự (2015, 2017, 2019) và Sikorskaya cùng cộng sự (2018) [81,76,77,85,86]. Sử dụng máy sắc kí lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC- HRMS).
Lipid tổng của các mẫu rong biển sau khi đã loại lớp màu được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ phân giải cao (HPLC- HRMS) với cột Shim- Pack diol (ID 50mm x 4,6mm, kích thước hạt 5μm, Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản).
Hàm lượng và cấu trúc của các dạng phân tử trong lớp lipid phân cực được phân tích bởi hệ thống LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản), quá trình phân tích được thực hiện trong chế độ ion hĩa phun mù điện tử (ESI) với nhận dạng đồng thời các tín hiệu của ion dương và âm. Q trình qt được thực hiện trong phạm vi m/z từ 100-1200. Điện áp nguồn là -3,5 kV trong trường hợp hình thành ion âm và 4,5 kV trong trường hợp hình thành ion dương. Nhiệt độ của nguồn ion là 250°С; áp suất khí N2 200 kPa; tốc độ dịng khí N2 là 1,5L/min. Buồng va chạm của khối phổ kế sử dụng khí Argon với áp suất 0,003 Pa. Các dạng phân tử riêng lẻ của lipid phân cực được phát hiện bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn xác thực trên phần mềm xử lý Shimadzu LC-MS (v.3.60.361) cĩ tính sai số tuyệt đối (difference) các tín hiệu ion thu được.
Việc định lượng các dạng phân tử riêng lẻ trong mỗi phân lớp của lipid phân cực được thực hiện bằng cách tính diện tích của từng peak sắc ký ion so với tổng diện tích các peak nhận diện được.
2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.2.5.1. Hoạt tính bẫy gốc tự do
Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) theo phương pháp Brand-Williams và cộng sự (1995), Shela cùng cộng sự (2003) và Kumar cùng cộng sự (2013) [94-96], là những phương pháp đã được cơng nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hĩa.
Dựa trên nguyên tắc DPPH cĩ khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch etanol bão hồ. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất cĩ khả năng làm trung hồ hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hố được đánh giá thơng qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sĩng 515 nm [94-97].
2.2.5.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trong các mẫu lipid của rong biển được thực hiện theo phương pháp của Vlietinck A.J. (1998) và Vanden Berghe (1991) [92, 93].
2.2.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn lipid rong biển trên các dịng tế bào ung thư được thực hiện theo phương pháp của Monks A (2011) [98], là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất cĩ khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [99,100, 101].
2.2.5.4. Hoạt tính kháng viêm
Khả năng kháng viêm của các mẫu lipid được thử nghiệm in vitro qua khả
năng ức chế sinh NO của tế bào RAW 264.7 bằng LPS, sử dụng thuốc thử Griess (Promega, USA) theo phương pháp của Liao H (2014), Combet S (2000), Tsai PJ (2007) và Cheenpracha S (2010) [87-91].
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM
Các mẫu rong biển được tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ như sau: