CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.2. Lipid rong biển
1.2.3. Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về lipid rong biển
Năm 1989, Harwood và Jones nghiên cứu về lipid của một số lồi rong biển đã chỉ ra một số lồi rong cĩ hàm lượng AA lên đến gần 20% lipid tổng ví dụ ở lồi Fucus
vesiculosus (Phaeophyta) là 15% và ở lồi Chondrus crispus (Rhodophyta) là 18% [58].
Năm 1990, Dembitsky và cộng sự đã nghiên cứu thành phần axit béo của các lồi rong Nâu thu từ Biển Đen. Kết quả cho thấy các axit béo chính của chúng là 16:0, 18:1, 18:3, 18:4 và 20:5. Hàm lượng monoglycosyldiacylglycerol (MGDG) dao động từ 26,8 đến 46,5% tổng glycolipid, hàm lượng diglycosyldiacylglycerol (DGDG) từ 19,6 đến 44,1% và hàm lượng sulphoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) từ 17,5 đến 51,7%. Tỷ lệ các chất béo nĩi chung trong các lồi khác nhau dao động từ 1,2 đến 4,9% và các phospholipid từ 2,9 đến 19,7%. Các phospholipid chính tìm thấy trong các lồi rong Nâu này là phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol
(PG) và phosphatidylethanolamin (PE); Tuy nhiên, một số lồi rong biển được tìm thấy cĩ chứa PE, PG và PI là chính và vắng mặt PC [59].
Năm 1993, nhĩm tác giả Waldemar đã cơng bố kết quả về hàm lượng lipid của hơn 100 lồi đại diện cho tất cả 16 họ rong Nâu (Phaeophyta) bằng phương pháp TLC. Kết quả là các glycolipid như monogalactosyldiacylglycerol, digalactosyldiacylglycerol, sulphoquinovo-syldiacylglycerol, các phospholipid như phosphatidylglycerol và phosphatidylethanolamine cĩ mặt trong tất cả các lồi được kiểm tra. Sự xuất hiện của phosphatidylcholine (thuộc phospholipid) và diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-p-alanine (DGTA) (thuộc betaine lipid) được sử dụng như tín hiệu phân loại hĩa học đối với lồi rong Nâu. Dựa trên giới hạn phát hiện là 0,5 pg/mg lipid tổng, xác định được DGTA cĩ trong các bộ Tilopteridales, Dictyotales, Notheiales, Fucales, Durvillaeales, Sphacelariales nhưng khơng thấy ở các bộ Sporochnales, Desmarestiales, Dictyosiphonales, Laminariales, Ascoseirales, Syringodermatales, Cutleriales và Scytosiphonales. Ectocarpales và Chordariales là các nhĩm hỗn hợp cĩ lồi cĩ DGTA và cĩ lồi khơng. Các tác giả cũng khơng thấy sự xuất hiện của phosphatidylcholine trong các bộ Dictyotales và Durvillaeales, trừ một vài mẫu thuộc bộ Fucales. Nhĩm tác giả cũng nhận thấy rằng nhĩm diacylglyceryltrimethylhomoserine (DGTS) chỉ cĩ khả năng xuất hiện một lượng nhỏ trong một số ít lồi được nghiên cứu [60].
Năm 2002, Khotimchenko nghiên cứu axit béo của một số lồi rong biển ở biển Thái Bình Dương đã xác định cĩ 7/7 lồi thuộc ngành rong Đỏ (Rhodophyta) cĩ mặt AA với hàm lượng từ 5,3 đến 23,4% lipid tổng, 9/9 lồi rong Nâu Phaeophyta cĩ mặt AA với hàm lượng từ 7,9 đến 18,6% lipid tổng và 3/3 lồi rong Lục Chlorophyta cĩ mặt AA đạt 0,3 đến 1,2% lipid tổng. Hàm lượng lipid tổng của các ngành rong tương ứng là rong Đỏ 6,4 đến 46,4mg/g rong khơ, rong Nâu là 24,4 đến 68,1mg/g rong khơ và rong Lục là 30,6 đến 60mg/g rong khơ [61].
Từ lồi rong Đỏ Gigartina tenella một sulfolipid (51) thuộc nhĩm SQDG đã được Ohta và cộng sự phân lập. Hợp chất này cĩ tác dụng ức chế hoạt động của các dạng α- và β-polymerase DNA ở động vật cĩ vú và terminal deoxynycleoridyl transferase (TdT). Các liều ức chế hồn tồn đối với polymerase dạng α và TdT là 1-2 µg/ml và với β-polymerase là 7,5 µg/ml [62].
Một hợp chất SQDG khác được Wang và cộng sự (2007) phân lập lần đầu tiên từ lồi rong Lục Caulerpa raremosa ỏ miền Nam Trung Quốc cĩ hoạt tính ức chế rất tốt HSV-2 với IC50=15 µg/ml. Bằng các phương pháp phổ đã xác định được hợp chất này cĩ cấu trúc (2S)-1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6’-sulfo-α-D- quinovopyranosyl) glycerol [63].
Lipid tổng của các lồi Laurencia popillose, Galaxoura cylindriea cĩ nguồn gốc từ biển Đỏ, và ba lồi Ulva fasciata, Dilophys fasciola, Taonia atomaria từ biển Địa Trung Hải đã được nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, kháng virus, kháng khuẩn và các hoạt tính chống oxy hĩa. Những mẫu dịch chiết lipid thơ ở nồng độ 10 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của virut HSV-1, tỉ lệ ức chế dao động 12,5 - 74,4%. Ở nồng độ 20 mg/ml lipid tổng các lồi Dilophys fasciola, Taonia atomaria, Galaxoura cylindriea ức chế hồn tồn virut HSV-1. Lipid của tất cả năm
lồi đều cĩ hoạt tính kháng vi sinh vật đáng chú ý với vi khuẩn Escherichia coli,
nấm men Aspergillus niger và Candida albicans, khơng dịch chiết nào thể hiện hoạt tính ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis. Hoạt tính chống oxy hĩa được đánh giá dựa
vào khả năng khử gốc tự do DPPH. Phần lớn lipid tổng của năm lồi đều cĩ hoạt tính chống oxy hĩa với các mức độ khác nhau. Tỉ lệ khử gốc tự do DPPH dao động trong khoảng 12,17 - 90,88% ở nồng độ 100 μg lipid tổng, trong đĩ hoạt tính cao nhất thể hiện ở lồi D. fasciola (90,88%). Hoạt tính kháng u của các mẫu được thử nghiệm trên các dịng tế bào ung thư vú (MCF7) và tế bào ung thư gan người (HepG2). Kết quả cho thấy, ở các nồng độ khác nhau, dịch chiết thơ của các mẫu đều thể hiện tác dụng ức chế mạnh trên cả hai dịng tế bào với giá trị IC50 dao động từ 0,34 đến 7,11 μg/ml. Trong đĩ, thể hiện hoạt tính cao nhất cả ở 2 dịng tế bào ung thư là lipid của lồi T. atomaria ở tất cả các nồng độ nghiên cứu, tỉ lệ ức chế tế bào khối u dao động lần lượt từ 77,21 đến 82,34% và 42,0 đến 61,0% đối với các tế bào MCF7 và HepG2. Giá trị IC50 đối với MCF7 là 0,34 μg/ml, thấp hơn nhiều so giá trị tương ứng của thuốc kháng u Novatrone. Phân đoạn phospholipid khoảng 3-8%
lipid tổng cĩ thành phần chính gồm PS, PA, PE, LPC và PG. Kết quả thử nghiệm các hoạt tính cho thấy tất cả các phân đoạn phospholipid từ 5 lồi rong trên đều thể hiện hoạt tính chống oxy hĩa, kháng virut HSV-1 tốt, kháng khuẩn (MIC = 40 - 80µg/ml), kháng các dịng tế bào ung thư MCF7 và HepG2 với giá trị IC50 0,47 - 3,15µg/ml [64].
Năm 2015, lipid từ các lồi Ulva armoricana (Chlorophyta) và Solieria chordalis (Rhodophyta) ở Brittany, Pháp đã được nhĩm tác giả Melha Kendel tiến
hành nghiên cứu. Kết quả cho thấy, hàm lượng lipid tổng là 2,6% và 3,0% trọng lượng khơ đối với U. armoricana và S. chordalis. Các thành phần chính của S. chordalis là lipid trung tính (37%) và glycolipid (38%), trong khi U. armoricana
chỉ chứa chủ yếu là lipid trung tính (55%). Axit béo khơng no đa nối đơi (PUFA) tính được là 29% và 15% tổng số chất béo trong U. armoricana và S. chordalis. Trong cả hai lồi rong được nghiên cứu, phospholipid được tạo thành từ PUFA chiếm tới 18%. Ngồi ra, PUFA được chứng minh là đại diện cho 9% glycolipid trong U. armoricana và 4,5% trong S. chordalis., PUFA chủ yếu là 16:4n-3, 18:4n- 3, 18:2n-3, 18:2n-6 và 22:6n-3 trong U. armoricana và 20:4n-6, 20:5n- 3 trong S. chordalis. Điều quan trọng là sự xuất hiện của sáu axit hydroxy- 3, 3-hydroxy-, và
hai axit béo hydroxy khơng no một nối đơi cũng được xác định và cĩ thể dùng cho phân loại hĩa học hai lồi rong này. Những loại rong biển này cịn chứa các hợp chất đáng quan tâm như squalene, α-tocopherol, cholest-4-en-3-one và phytosterol. Tác dụng chống tăng sinh đã được đánh giá trên dịng tế bào ung thư NSCLC-N6 cho các giá trị IC50 là 23μg/ml đối với monogalactosyldiacylglycerol phân lập từ S.
chordalisand và 24μg/ml đối với các digalactosyldiacylglycerol từ U. armoricana.
Những kết quả này đã xác nhận tiềm năng sử dụng của hai lồi này trong các lĩnh vực y tế, dinh dưỡng và phân loại hĩa học [65].
Năm 2016, Masaki Honda và cộng sự đã nghiên cứu các lớp chất lipid, axit béo và thành phần glycerolipid trên đối tượng rong câu Gracilaria vermiculophylla, vốn được coi là nguồn dự trữ hoạt chất prostaglandin như PGE2 và PGF2α. Trong nghiên cứu này, tác giả đã làm rõ các đặc tính của glycerolipid dùng làm cơ chất cho q trình chuyển hĩa thành prostaglandin. Các lớp lipid, thành phần axit béo và các dạng phân tử glycerolipid cũng đã được nghiên cứu sâu hơn trên đối tượng này. Các lớp lipid chính trong lồi G. vermiculophylla là monogalactosyldiacylglycerol
(MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), và sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG), cũng như phosphatidylcholine (PC), chiếm tới 43,0% tổng số lipid. Axit arachidonic (20:4n-6, tiền chất prostaglandin) và axit palmitic (16:0) là các axit béo chiếm ưu thế trong lipid tổng. Hàm lượng axit béo 20:4n-6 cao nhất trong lớp MGDG và PC (hơn 60%). Hàm lượng axit 16:0 cao đáng kể trong DGDG và SQDG với hơn 50%. Các phân tử glycerolipid chính bao gồm 20:4n-6/20:4n-6 (sn-1/sn-2) cho MGDG (56,5%) và PC (40,0%), 20:4n-6/16:0 cho DGDG (75,4%) và SQDG (58,4%). Từ đĩ, các tác giả cho rằng các phân tử glycerolipid cĩ chứa một hoặc hai axit béo 20:4n-6 là các chất nền chính cho sản xuất prostaglandin trong G. vermiculophylla [66].
Năm 2017, Costa và cộng sự đã xác định được hơn 147 dạng phân tử trong lipid của chi Gracilaria được phân bố trong các loại glycolipid như monogalactosyl diacylglyceride (MGDG), digalactosyl diacylglyceride (DGDG), sulfoquinovosyl monoacylglyceride (SQMG), sulfoquinovosyl diacylglyceride (SQDG), phospholipid như phosphatidylcholine (PC), lyso-PC, phosphatidylglycerol (PG), lyso-PG, phosphatidylinositol (PI), phosphatidylethanolamin (PE), axit photphat (PA), inositolphosphoceramide (IPC) và betaine lipid như monoacylglyceryl và diacylglyceryl-N, N, N- trimethyl homoserine (MGTS và DGTS). Nhĩm tác giả cũng đã thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào ung thư và khả năng chống viêm của lipid từ lồi Gracilaria sp., kết quả cho thấy lipid của lồi này cĩ khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú T-47D và tế bào ung thư bàng quang 5637 với giá trị IC50 lần lượt là 12,2µg/ml và 12,9µg/ml và ức chế việc sản sinh NO trên dịng tế bào RAW 264.7 với khả năng ức chế 35% ở nồng độ 100µg/ml. Những phát hiện này gĩp phần làm tăng vai trị của Gracilaria sp. khi các sinh khối này được trồng trong điều kiện kiểm sốt trên hệ thống IMTA [67].
Năm 2018, Giulia và cộng sự nhận thấy rong biển và dịch chiết lipid của chúng đã thu hút sự quan tâm lớn trong ngành cơng nghiệp dược và được đánh giá như một nguồn cung cấp các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học cao. Nhĩm tác giả đã sử dụng phương pháp phân tích sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) để kiểm tra hàm lượng lipid, axit béo từ cặn chiết lồi rong Nâu Padina pavonica (EPP) thu tại Pháp, cung cấp dữ liệu về lipid và sterol của EPP [68].
Năm 2019, Costa và cộng sự dùng phương pháp phổ khối phân giải cao HILIC - MS và MS/MS đã xác định được 187 dạng phân tử thuộc mười tám nhĩm của ba phân lớp glycolipid, phospholipid và betaine lipid từ lồi rong Nâu Fucus vesiculosus. Trong nghiên cứu này, các tác giả qua sử dụng phân tích cấu tử chính
(PCA) và phân tích chùm đối với các lớp lipid phân cực, các loại lipid phân cực và bộ dữ liệu axit béo (FA) đã chỉ ra cĩ sự phân nhĩm theo mùa [69].
Ở Việt Nam, nghiên cứu về lipid của rong biển mới chỉ cĩ các cơng bố của nhĩm nghiên cứu Lê Tất Thành và cộng sự trên 70 mẫu rong Đỏ cho kết quả hàm lượng lipid dao động từ 0,12 - 1,39% khối lượng rong tươi. Từ kết quả phân tích thành phần axit béo các tác giả đã xác định được 12 axit béo chính yếu của các lồi rong Đỏ là C14:0, C15:0, C16:0, C16:1n-7, C18:0, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:0 và sử dụng phép phân tích chùm PCA để phân biệt 69 mẫu thuộc 3 họ rong Đỏ thu ở biển Việt Nam là Gracilariaceae, Hypneaceae và Ceraminaceae. Từ lồi rong câu thu ở vùng biển Viễn Đơng - LB Nga Gracilaria vermiculophylla đã phát hiện được Prostaglandin E2 (PGE2) và Prostaglandin E3 (PGE3), ngồi ra 14 mẫu rong Đỏ Việt Nam cũng cĩ PGE2 với hàm lượng thấp hơn từ 6 - 20 lần mẫu rong của Nga. Nhĩm nghiên cứu đã phát hiện mối liên hệ đồng biến giữa hàm lượng axit béo arachidonic (AA) và PGE2 trong lồi
Gracilaria vermiculophylla cũng như sự giảm dần hàm lượng của chúng trong quá
trình nuơi trồng của Việt Nam [53].
Tiếp tục hướng nghiên cứu về lipid rong biển, ngồi nội dung sàng lọc hĩa sinh theo cách truyền thống, luận án cịn tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học in- vitro và xác định các dạng phân tử lipid phân cực của 2 lồi Lobophora sp. và
Halimeda incrassata Lamx.. Đây là 2 lồi được thu ở Cơn Đảo và Trường Sa.
Ngồi yếu tố địa lý là những khu đảo đặc thù của Việt Nam, sự lựa chọn các lồi này cịn dựa trên kết quả sàng lọc lipid và axit béo của 50 lồi rong biển (xem mục
4.1) và đặc điểm riêng của từng lồi. Lobophora sp. là lồi thứ hai duy nhất của chi Lobophora được phát hiện ở Việt Nam đồng thời lại là một lồi mới. Halimeda incrassata Lamx. khơng chỉ là một trong số ít thực vật cĩ khả năng sản sinh CaCO3
cao (35-45%) [70] ngang bằng san hơ, đĩng vai trị quan trọng trong việc hình thành các rạn bảo vệ nền đáy trước bão lũ và dịng chảy ven bờ mà cịn đang rất được quan tâm trên thế giới về hoạt tính sinh học [21-23,26-28]. Cho đến nay chưa cĩ
cơng bố nào về lipid, axit béo và các dạng phân tử lipid phân cực của 2 lồi này. Kết quả nghiên cứu khơng chỉ tạo cơ sở khoa học để bảo tồn, phát triển và sử dụng hai lồi này mà cịn gắn kết việc cơng bố các dữ liệu khoa học mới về tài nguyên biển đảo với việc khẳng định chủ quyền và tồn vẹn lãnh thổ Việt Nam.
Việc phân tích định tính và định lượng các dạng phân tử lipid phân cực là một bài tốn phức hợp cần phải giải quyết bằng nhiều phương pháp, trong đĩ phương pháp phổ khối lượng là một phương pháp quan trọng để phân tích cấu trúc lipid trong một hỗn hợp [71-73]. Chúng tơi đã lựa chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-HRMS) trên thiết bị LC/MS- IT-TOF để nghiên cứu.