carrageenan Giải thích quy trình
Rong sụn khô Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc thu mua tại các xã tại huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận.
Cho rong vào nƣớc ngọt ngâm 20-30 phút, vừa ngâm vừa khuấy trộn nhằm rửa mặn và giảm bớt lƣợng tạp chất bám trên rong.
Sau đó rong đƣợc sấy khô khoảng 600C cho đến khi lƣợng ẩm còn 5-
10 %, rong đƣợc xay nhuyễn chuẩn bị cho quá trình chiết carrageenan.
2.4.1.2. Chiết carrageenan
Bột rong sụn đƣợc cho vào nƣớc máy sạch với tỉ lệ bột rong : nƣớc = 1 :50 và đun nóng đến nhiệt độ 80 – 90 0C, khuấy trộn liên tục cho đến khi rong nát. Sau khi lọc nóng, dịch chiết đƣợc để riêng và để nguội đến 400C, tủa
carrageenan từ dịch chiết bằng cồn với tỉ lệ cồn : dịch chiết = 1 : 3. Tiếp tục lọc lấy tủa carrageenan và đem đi sấy ở 60 0C cho đến khi khối lƣợng không đổi, sau nghiền ta đƣợc bột carrageenan.
Bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty
Tỉ lệ rong:nƣớc = 1:50, 900C, 3 - 4 giờ Lọc nóng Bã Tủa cồn 960, tỉ lệ dịch chiết : cồn = 1:3 Cồn thu Lọc hồi Sấy khô 600C Bột carrageenan nguyên liệu
Hình 2.3. Qui trình chiết carrageenan từ bột rong sụn Kappaphycus alvarezii
(Doty) Doty
Bột Carrageenan Bột oligo carrageenan Hình 2.4. Sản phẩm bột oligo carrageenan trƣớc và sau khi thủy phân
2.4.2. Thủy phân rong sụn bằng các axít ở các điều kiện khác nhau
2.4.2.1. So sánh hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit
Bột carrageenan nguyên liệu Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v);
Xúc tác axit: H2SO4, C6H8O6 (axit ascorbic) Thời gian: 90 phút
Nhiệt độ: 90 0
C;
Nồng độ axit (M)
0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng
Lựa chọn nồng độ axit thích hợp
2.4.2.2. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo thời gianBột carrageenan Bột carrageenan nguyên liệu Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v); H2SO4, C6H8O6,: Nồng độ lựa chọn Nhiệt độ: 90 0 C; Thời gian (phút) 30 60 90 120 150
Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng
Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp
Hình 2.6. Qui trình thủy phân các loại axit theo thời gian
Carrageenan dạng bột với hàm lƣợng 2 % (w/v) đƣợc thủy phân hóa học bằng xúc tác axit với hai loại axit hữu cơ (axit ascorbic) và axit vô cơ (axit sulfuric) ở các điều kiện thủy phân khác nhau. Sau quá trình thủy phân, đánh giá hiệu suất thủy phân dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng, từ đó lựa chọn giá trị trung tâm của các điều kiện thủy phân để thực hiện quá trình tối ƣu hóa.
2.4.2.3. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo nhiệt độBột carrageenan Bột carrageenan nguyên liệu Thủy phân: Bột carrageenan: 2 % (w/v); H2SO4, C6H8O6: Nồng độ lựa chọn Thời gian: Thời gian lựa chọn
Nhiệt độ (0C)
60 70 80 90
Xác định hiệu suất dựa trên hàm lƣợng carbohydrat tổng
Lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Hình 2.7. Qui trình thủy phân các loại axit theo nhiệt độ
2.4.3. Thu hồi oligo carrageenan
Dịch sau khi thủy phân bằng phƣơng pháp thủy phân với xúc tác axit đƣợc đem đi thu hồi oligo-carrageenan bằng phƣơng pháp tủa cồn: tỉ lệ dịch thủy phân:cồn 960 = 1:9, lọc và sấy khô oligo-carrageenan thu đƣợc ở nhiệt độ 60 0C.
2.4.4. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng
Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều
rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn.
2.4.5. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch thủy phân [54] thủy phân [54]
Sau quá trình thủy phân, tiến hành lọc dịch thủy phân: xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng và tính hiệu suất thủy phân theo công thức:
Trọng lƣợng phân tử trung bình của oligo carrageeenan trong dịch sau thủy phân đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC).
2.4.6. Đƣa ra điều kiện thủy phân tối ƣu cho dịch chiết sau thủyphân phân
Sử dụng phần mềm Design Expert (DE 10.0.8) để thiết lập bài toán tối ƣu dựa trên phƣơng trình hồi quy xác định bằng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm; là hàm mô tả sự phụ thuộc của hàm lƣợng carbohydrat tổng vào các nhân tố điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, thời gian và nhiệt độ thủy phân.
Sau bƣớc sàng lọc ban đầu, thí nghiệm theo phƣơng pháp RSM-CCD đƣợc thực hiện để tối ƣu hóa giá trị các yếu tố đang đƣợc nghiên cứu. Đây là phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố dựa trên cơ sở mô hình hình hóa toán học. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp đáp ứng bề mặt (RSM) là làm thực nghiệm tại một số điểm của các yếu tố để mô tả kết quả bằng một phƣơng trình hồi quy dạng đa thức bậc 2. Phƣơng trình đó giúp vẽ trên hệ trục tọa độ một đồ thị dạng mặt – gọi là bề mặt đáp ứng, điểm tối ƣu là điểm cực trị của đồ thị đó.
2.4.7. Khảo sát khả năng kích thích sinh trƣởng của dịch oligo carrageenan trên cây ngô.
Dịch oligo carrageenan sau khi thu đƣợc từ quá trình thủy phân carrageenan ở các điều kiện tối ƣu, đƣợc xác định trọng lƣợng phân tử trung
bình và đặc trƣng cấu trúc hóa học; sau đó đƣợc sử dụng làm phân bón lá và phun trên cây ngô ở các nồng độ carbohydrat khác nhau, quá trình thực nghiệm đƣợc trình bày ở Phụ lục 3.
2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Hàm lƣợng carbohydrat tổng đƣợc phân tích 3 lần, kết quả lấy trung bình cộng của các lần phân tích, xử lý số liệu bằng phần mềm Excel với hệ số tƣơng quan R ≥ 0,95. Phần mềm Design Expert (DE 10.0.8) đƣợc sử dụng để tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN
Kết quả phân tích thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus
Alvarezii đƣợc thểhiện ởBảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong Sụn– Kappaphycus alvarezii
Thành phần hóa học Tỉ lệ (%) Carbohydrate 53,15 Tro 30,75 Độ ẩm 9,73 Protein 5,72 Lipid 0,65
Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy rong biển sinh trƣởng tại Ninh Thuận và thu hoạch vào tháng 6 năm 2018 có hàm lƣợng protein nhỏ hơn, hàm lƣợng tro và lipit là tƣơng đƣơng so với các công trình công bố trên thế giới; theo nhƣ Fujiwara và cộng sự [55], Ruperes [56] và Hertreau [57], thì hàm lƣợng protein trong rong đỏ chứa từ 10 đến 47 %, hàm lƣợng tro dao động từ 20 đến 40 % và hàm lƣợng lipit < 4 %. Hàm lƣợng tro cao trong rong biển có liên quan đến khả năng hấp thụ khoáng chất và các nguyên tố vi lƣợng từ môi trƣờng xung quanh. Ngoài ra kết quả này cũng tƣơng đồng với kết quả phân tích thành phần rong sụn Kappaphycus alvarezii thu hoạch tại Ninh Thuận tháng 04 năm 2009 của TS. Bùi Minh Lý và cộng sự [58]: protein 4,5 %, lipit 0,4 %, tro 28,6 %.
3.2. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO CARBOHYDRAT TỔNG
3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ axit
3.2.1.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit
Kết quả xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng theo nồng độ axit đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2 cho thấy hàm lƣợng carbohydrat tổng thu đƣợc dao động trong khoảng từ 7,73±0,34 g/L đến 11,12±0,44 g/L.
Ảnh hƣởng của nồng độ axit đến hiệu suất thủy phân đƣợc biểu diễn ở hình 3.1 cho thấy thủy phân bằng axit ascorbic tạo ra hiệu suất cao hơn so với axit sulfuric ở tất cả các nồng độ. Khi tăng nồng độ cao hơn 0,2 M thì hiệu suất khi thủy phân bằng axit sulfuric có dấu hiệu tăng chậm, trong khi đó axit ascorbic làm hiệu suất tăng cao. Để xác định ảnh hƣởng của nồng độ đến hiệu
suất có mối tƣơng quan hay không, lập phƣơng trình hồi qui Y1 = 40,79 +
36,6*X1 (bảng PL1.1), với Y1 là biến phụ thuộc ứng với hiệu suất thủy phân, X1 là biến độc lập ứng với nồng độ axit ascorbic. Nhƣ vậy quan hệ giữa hiệu suất và nồng độ là mối quan hệ tuyến tính bậc 1, với hệ số hồi qui bằng + 36,6 thì nồng độ axit ascorbic và hiệu suất thủy phân là mối quan hệ thuận. Mặt khác có thể thấy hệ số tƣơng quan R = 0,9785 (0,9 ≤ R ≤ 1) nên có thể kết luận rằng giữa nồng độ axit và hiệu suất thủy phân có mối liên hệ tƣơng quan thuận và rất chặt, hay nói cách khác hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng khi nồng độ axit tăng.
Cụ thể khi thủy phân rong sụn bằng axit ascorbic 0,05 M đã thu nhận hàm lƣợng carbohydrat tổng là 8,26±0,32 g/L. Khi tăng nồng độ axit lên 0,1 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng thu đƣợc tăng cao lên 9,19±0,38 g/L. Tiếp tục tăng nồng độ lên các khoảng 0,2 và 0,3 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng có xu hƣớng tăng và ở nồng độ axit cao nhất trong phạm vi nghiên cứu là 0,4 M thì hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng lên 11,12±0,44 g/L, tƣơng ứng với hiệu suất thủy phân 55,6 % (Hình 3.1).
Trong khi đó khi sử dụng axit vô cơ, phƣơng trình hồi qui có dạng Y2
= 39,68 + 20,52*X2 (bảng PL1.2) với Y2 là biến phụ thuộc ứng với hiệu suất thủy phân, X2 là biến độc lập ứng với nồng độ axit sulfuric, nhƣ vậy giữa
nồng độ axit sulfuric và hiệu suất thủy phân cũng là mối quan hệ tuyến tính bậc 1 và là mối quan hệ thuận do có hệ số hồi qui dƣơng là + 20,52. Với hệ số tƣơng quan R = 0,8762 (0,7 ≤ R < 0,9), thấp hơn so với axit ascorbic, nên có thể kết luận rằng mối phụ thuộc giữa nồng độ axit sulfuric và hiệu suất thủy phân là mối phụ thuộc thống kê (có liên hệ tƣơng quan chặt) và quan hệ thuận với nhau. Hàm lƣợng carbohydrat tổng tăng trong khoảng nồng độ từ 0,05 M đến 0,2 M, tăng 18,11 % (từ 7,73±0,34 g/L lên 9,13±0,08 g/L) và hầu nhƣ tăng chậm trong khoảng từ 0,2 đến 0,4 M, tăng 2,19 % (từ 9,13±0,08 lên 9,33±0,45 g/L).
Nhƣ vậy có thể thấy hiệu suất thủy phân khi thủy phân bằng axit ascorbic cao hơn so với axit sulfuric ở cùng nồng độ 0,4 M tƣơng ứng là 55,6
% và 46,65 %, trong khi đó ở cùng nồng độ axit 0,2 M sự chênh lệch hiệu
suất thủy phân của hai loại axit không đáng kể, axit ascorbic là 48,6 % và axit sulfuric là 45,65 %.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột
carrageenan Axit Nồng độ axit (M) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 C6H8O6 (axit 8,26 ± 0,32 9,19±0,38 9,72±0,22 10,19±0,36 11,12±0,44 ascorbic) H2SO4 (axit 7,73 ± 0,34 8,55±0,46 9,13±0,08 9,25 ± 0,38 9,33 ± 0,45 sulfuric)
Để đánh giá giữa hai dãy số liệu từ thực nghiệm có sự khác biệt về trung bình tổng thể mang ý nghĩa thống kê hay không, tiến hành xử lý thống kê bằng phần mềm Excel với phƣơng pháp thống kê t-test: là phƣơng pháp kiểm định giả thuyết về sự khác biệt giữa hai trung bình tổng thể khi hai tổng thể độc lập và số lƣợng các quan sát trong mẫu là nhỏ. Hai dãy số liệu đầu
thực nghiệm thực nghiệm
60
Hiệu suất thủy phân (%)
50
40
30
C6H8O6 (axit ascorbic)
H2SO4 (axit sulfuric)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Nồng độ axit (M)
Hình 3.1. Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột
carrageenan
Trƣớc tiên cần so sánh phƣơng sai của hai dãy số liệu, cũng sử dụng phƣơng pháp kiểm định giả thuyết với giả thuyết H0 là hai dãy số có phuơng
sai bằng nhau và H1 là hai dãy số có phƣơng sai không bằng nhau. Kết quả
kiểm định bằng chức năng F-test two samples for variances (bảng PL1.3) trong phần mềm Excel cho thấy giá trị F = 2,55 nhỏ hơn giá trị F lý
thuyết = 6,38, theo tính toán thống kê thì chấp nhận giả thuyết H0, tức là phƣơng sai của hai dãy số không khác nhau.
Tiếp tục kiểm định giả thuyết hai dãy số liệu có khác biệt về trung bình
tổng thể hay không, sử dụng chức năng thống kê T-test two sample asuming
equal variance (bảng PL1.4) với phƣơng sai hai tổng thể không khác nhau trong phần mềm Excel, với giả thuyết H0 là hai dãy số có trung bình tổng thể không khác biệt và H1 là hai dãy số có trung bình tổng thể khác biệt.
Kết quả kiểm định sự khác biệt cho thấy giá trị kiểm định t
(1,58) nhỏ hơn giá trị t lý thuyết (2,30), nhƣ vậy chấp nhận giả thuyết H0, hay nói cách khác không có sự khác biệt có ý nghĩa về trung bình của hai dãy số.
Nhƣ vậy có thể thấy mặc dù trung bình của hai dãy số có sự chênh lệch (48,48 và 43,99) nhƣng sự chênh lệch này không có sự khác biệt có ý nghĩa. Hai dãy số liệu về hiệu suất thủy phân theo nồng độ của hai loại axit hữu cơ và axit vô cơ có thể đƣợc sử dụng để nội suy thống kê và lựa chọn nồng độ axit thích hợp.
3.2.1.2. Lựa chọn nồng độ axit thích hợp
Để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo, nồng độ axit cần đƣợc lựa chọn thích hợp và đƣợc giữ làm nồng độ cố định trong quá trình thí nghiệm. Để thống nhất một nồng độ axit thích hợp, dãy số liệu về hiệu suất thủy phân từ axit ascorbic đƣợc lựa chọn để khảo sát.
Phƣơng pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (Response Surface) với kiểu thiết kế dữ liệu lịch sử (Historical Data) và mô hình thiết kế bậc hai của phần mềm Design Expert (DE 10.0.8) đƣợc sử dụng để lựa chọn tối ƣu nồng độ axit thấp nhất ứng với hiệu suất thủy phân cao nhất. Với dữ liệu thống kê là hiệu suất thủy phân bằng axit ascorbic, kết quả phân tích thống kê Anova đƣợc trình bảy ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích thống kê với sốliệu hiệu suất thủy phân theonồng độ axit
Thông số thống kê Giá trị
F Value 66,78 p-value 0,0038 R-Squared 0,9570 Adj R-Squared 0,9427 Pred R-Squared 0,8729 Adeq Precision 15,793
Với kết quả phân tích thống kê Anova trong phần mềm, hiệu số giữa Adj R-Squared (0,9457) và Pred R-Squared (0,8729) nhỏ hơn 0,2 cho thấy mô hình phù hợp với dữ liệu và có thể đƣợc sử dụng một cách đáng tin cậy để nội
suy. Bên cạnh đó, giá trị Adeq Precision (15,793) lớn hơn 4, mô hình có tín hiệu đủ mạnh để đƣợc sử dụng để tối ƣu.
Với điều kiện ràng buộc là nồng độ axit nhỏ nhất và hiệu suất thủy phân cao nhất với độ ƣu tiên nhƣ nhau, phần mềm đã lựa chọn đƣợc một giải pháp tối ƣu: nồng độ axit là 0,207 M ứng với hiệu suất thủy phân dự đoán là 48,36 %, đáp ứng với phƣơng trình hồi qui: hiệu suất = 40,79 + 36,6*nồng độ. Có thể thấy hiệu suất thủy phân dự đoán (48,364 %) ở 0,207 M không chênh lệch nhiều so với từ thực nghiệm là 48,6 % ở nồng độ 0,2 M, vì vậy nồng độ axit 0,2 M đƣợc chọn là nồng độ thích hợp trong các thí nghiệm tiếp theo.
Nhận xét: Hàm lượng carbohydrat tổng của dịch sau thủy phân bị ảnh hưởng nhiều bởi nồng độ axit. Với phương pháp dự đoán tối ưu từ số liệu có ý nghĩa thống kê về nội suy, nồng độ 0,2 M được chọn là nồng độ thích hợp để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân
3.2.2.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit
Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hàm lƣợng carbohydrat tổng (Bảng 3.4) đƣợc khảo sát trong khoảng từ 30 đến 150 phút. Thủy phân bằng axit ascorbic cho kết quả dữ liệu thực nghiệm phù hợp với mô hình hồi qui tuyến tính bậc 1, mối quan hệ giữa thời gian và hiệu suất thủy phân đƣợc biểu diễn theo phƣơng trình Y1 = 36,09 + 0,15*X1, với Y1 là biến phụ thuộc ứng với hiệu suất thủy phân và X1 là biến độc lập ứng với thời gian thủy phân. Có thể thấy mối tƣơng quan giữa hiệu suất thủy phân và thời gian là quan hệ thuận với hệ số hồi qui dƣơng 0,15. Cụ thể ở thời gian từ 30 đến 90 phút, thủy phân bằng axit ascorbic làm tăng hàm lƣợng carbohydrat tổng từ 8,18±0,32 lên 9,72±0,22 g/L, tƣơng ứng với hiệu suất thủy phân tăng từ 40,9 % lên 48,6 %; và khi tăng thời