2.3.1.1. Phân tích protein thô [46]
Protein thô đƣợc xác định bằng phƣơng pháp micro Kjeldahl, đƣa vào bình nón chịu nhiệt 1 g mẫu rong, thêm vào đó 30 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10 g K2SO4 và 1 g CuSO4. Ban đầu hỗn hợp đƣợc đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đƣợc tăng mạnh lên. Khi dung dịch trở nên không màu hoặc trong suốt, đƣợc đun thêm 1 h nữa, để nguội, pha loãng với nƣớc cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800 mL. Đƣa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại và 100 ml dung dịch NaOH 40 % và bình đƣợc nối với đầu phun của thiết bị chƣng cất. Tiếp theo đƣa 25 ml dung dịch H2SO4 0,1 N vào trong bình hứng và chƣng cất. Khi hai phần ba lƣợng chất lỏng đã đƣợc chƣng cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hòa toàn chƣa. Bình thu đƣợc lấy ra chuẩn với dung
dịch NaOH nồng độ 0,1 N. Từ lƣợng H2SO4 bị mất đi xác định hàm lƣợng
nitơ. Sau đó chuyển đổi về hàm lƣợng protein: Tính kết quả
Protein tổng số của rong biển đƣợc tính bằng công thức sau: mProtein = mNitrogen x 6,25
2.3.1.2. Phân tích lipid thô [47]Tách lipid từ mẫu: Tách lipid từ mẫu:
Cân 1 g mẫu đã đƣợc bằm nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20 mL. Cho thêm 600 μl nƣớc cất, 5 mL methanol, 10 mL chloroform và 200 μL BHT (Butylated hydroxy toluen). Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dƣới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5mL methanol và 10 mL chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu đƣợc lọc hết hoàn toàn. Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 mL. Cho thêm 7,5 mL NaCl 0,9 % vào phễu chiết chứa
dịch mẫu. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5 oC trong
khoảng 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp.
Chiết rút dung dịch lipid
Tách lớp dƣới (chứa hàm lƣợng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất đƣợc loại nhƣ nƣớc, muối, protein….).
Xác định thể tích chiết ở trên (V). X = ¼ V (mL)
Cho thêm 5 mL MeOH 50 % vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 mL. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần. Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5 oC.
Định lƣợng lipid
Lớp dƣới đƣợc rút chảy xuống bình cầu 100 mL. Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37oC đến khi còn lại thể tích khoảng 1 mL. Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lƣợng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lƣợng mẫu đã làm khô với không khí). Chuyển lƣợng mẫu qua bình định mức 5 mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5 mL. Sau khi xử lý xong, dung dịch này đƣợc mang đi xác định hàm lƣợng lipid tổng. Dung dịch này có thể lƣu giữ trong tủ đông –20 oC.
Lấy chính xác 2 mL dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4 mL đã đƣợc sấy chân không và cân với lƣợng không đổi, làm khô bằng khí nitơ. Cho vào tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong một giờ.
Lipid tổng số (%) tính theo công thức:
% Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm % Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm
Xt: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng tƣơi của mẫu
Xk: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng khô của mẫu m1: Trọng lƣợng cân ống vial và mẫu sau sấy (g).
m0: Trọng lƣợng cân ống vial khối lƣợng không đổi (g).
m: Trọng lƣợng cân mẫu (g).
Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL)
T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100
W: Độ ẩm của mẫu (%)
2.3.1.3. Phân tích hàm lượng tro [46]
Chén nung đƣợc rửa sạch và nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 oC đến khối
lƣợng không đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến khi hóa than đen. Sau khi hóa than ta chuyển vào lò nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 oC để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lƣợng không đổi.
Tính kết quả
Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m
B: Khối lƣợng chén nung (g)
m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm.
2.3.1.4. Phân tích độ ẩm [46]
Sấy cốc đến khối lƣợng không đổi: Rửa sạch cốc, để khô, sấy ở nhiệt độ 130 oC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm, cân, tiến hành sấy tiếp ở nhiệt độ 130 oC khoảng 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, sấy tiếp đến khi nào khối lƣợng cốc giữa hai lần cân không lệch nhau quá 5.10-4 là đƣợc.
Cân chính xác 1,0 g rong biển khô (đã cắt nhỏ) cho vào cốc sấy đã xác định khối lƣợng không đổi. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 oC trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 130 oC trong 1 giờ. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân nhƣ trên cho tới khi khối lƣợng không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân không lệch nhau quá 0,5 mg cho mỗi mẫu chất thử.
Tính kết quả
Độ ẩm tính theo %
X = Hiệu số khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy / Khối lƣợng mẫu
trƣớc khi sấy
Carbohydrate tổng số:
Carbohydrate (%) = 100 - (% độ ẩm+ % protein+ % lipid +% tro) [52]