Thủy Thời gian Nhiệt độ Hàm lƣợng Hiệu suất
Nồng độ thủy
phân thủy phân carbohydrat thủy
axit (M) phân bằng (OC) tổng (g/L) phân (%) (phút) Axit 0,15 85,15 90 9,25 46,26 ascorbic Axit 0,15 85,74 90 8,62 43,12 sulfuric
3.3.2. Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn
Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit
Từ các kết quả khảo sát ở trên, quy trình thủy phân carageenan chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit đƣợc đề xuất ở Hình 3.6.
Thuyết minh quy trình:
Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty: Rong sụn
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc thu mua tại các xã tại huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận. Rong đã đƣợc rửa nƣớc biển, phơi khô, đóng gói vào các bao loại 50 kg và đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu.
Xử lý: Cho rong vào nƣớc ngọt ngâm 20-30 phút, vừa ngâm vừa khuấy trộn nhằm rửa mặn và giảm bớt lƣợng tạp chất bám trên rong. Sau đó
rong đƣợc sấy khô khoảng 60 0C cho đến khi lƣợng ẩm còn 5-10 %, rong đƣợc xay thành bột.
Bột rong: bột rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đóng gói vào các bao bì PE, bảo quản ở nhiệt độ thƣờng chuẩn bị cho quá trình chiết carrageenan.
Chiết carrageenan: chiết carrageenan với tỉ lệ bột rong : nƣớc =
1:50 ở 90 OC trong khoảng 3 – 4 giờ cho đến khi bột rong tan hoàn toàn.
Kết tủa carrageenan: sau khi chiết, lọc nóng dịch chiết qua vải lọc, tiến hành tủa carrageenan bằng ethanol 96O với tỉ lệ dịch chiết : ethanol = 1:3 trong thời gian 40 phút.
Lọc lấy carrageenan, sấy khô 60 OC: lọc lấy tủa carrageenan và sấy khô carrageenan thu đƣợc ở 60 OC đến khối lƣợng không đổi.
Carrageenan nguyên liệu:
các bao bì PE và bảo quản ở nhiệt phân hoặc phân tích phổ IR.
carrageenan sau sấy đƣợc đóng gói vào độ thƣờng, chuẩn bị cho quá trình thủy
Rong sụn Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty
Xử lý Bột rong
Ngâm nƣớc, khuấy trộn loại tạp, sấy khô 60OC, xay thành bột Chiết carageenan Kết tủa carrageenan Lọc lấy carrageenan, sấy khô 60OC Carrageenan nguyên liệu Thủy phân carrageenan Trung hòa về pH=7, lọc lấy dịch Dịch Oligo Carrageenan Tỉ lệ bột rong : nƣớc = 1:50, 90 0C, 3 – 4 giờ
Tủa carrageenan bằng ethanol 96O với tỉ lệ dịch chiết : ethanol = 1:3, 40 phút.
Carrageenan dạng bột: 2 % (w/v). Axit ascorbic: 0,15 M, 85 phút, 90OC.
Axit sulfuric: 0,15 M, 85 phút, 90OC
Hình 3.6. Quy trình đề xuất thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn
Thủy phân carrageenan: thủy phân carrageenan dạng bột với hàm lƣợng carrageenan 2 % (w/v), sử dụng hai loại xúc tác axit là axit ascorbic ở
nồng độ 0,15 M và axit sulfuric ở nồng độ 0,15 M; thủy phân ở điều kiện nhƣ nhau: thời gian 85 phút và nhiệt độ 90 OC. Trong quá trình thủy phân đảm bảo thể tích dung dịch thủy phân luôn ở mức ban đầu.
Lọc lấy dịch: sau thủy phân, trung hòa dịch thủy phân về pH = 7 bằng NaOH 0,1 M, lọc lấy dịch thủy phân.
Dịch Oligo Carrageenan: dịch sau thủy phân đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng trong chai nhựa và đƣợc phun qua lá trên cây ngô đánh giá khả năng kích thích sinh trƣởng, hoặc đƣợc thu hồi oligo carrageenan để phân tích phổ IR.
Nhận xét nội dung 3.3:
Với kết quả sau quá trình tối ưu hóa các điều kiện thủy phân, nồng độ axit đã giảm từ 0.2 M ở điểm trung tâm đã khảo sát thăm dò xuống còn 0.15 M khi thủy phân bằng axix ascorbic, thời gian thủy phân 85 phút vẫn cho hiệu suất không thay đổi nhiều; bên cạnh đó nồng độ axit sulfuric cũng giảm xuống còn 0,15 M. Hiệu suất thủy phân rong sụn bằng hai loại axit hữu cơ (axit ascorbic) và axit vô cơ (axit sulfuric) có giá trị tương đương, 46,26 % và 43,12 % tương ứng.
3.4. TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ TRUNG BÌNH CỦA OLIGOCARRAGEENAN CARRAGEENAN
Để xác định trọng lƣợng phân tử trung bình Mw của oligo carrageenan, dịch oligo carrageenan sau thủy phân đƣợc xác định bằng phổ GPC. Kết quả xác định trọng lƣợng phân tử trung bình Mw khi thủy phân carrageenan bằng axit ascorbic (Bảng 3.17) cho thấy: ở cùng nồng độ axit thấp nhất 0,05 M, Mw
thay đổi theo thời gian, khi tăng thời gian từ 60 phút lên 85 phút thì trọng lƣợng phân tử trung bình giảm từ 280,56 kDa xuống còn 53,24 kDa, tiếp tục
kéo dài thời gian thủy phân lên 120 phút thì Mw giảm xuống còn 6,60 kDa.
Trong khi đó ở hai nồng độ axit cao hơn là 0,15 M và 0,4 M, trọng lƣợng phân tử trung bình cũng giảm theo thời gian: tƣơng ứng với thời gian 60 và
120 phút, 219,04 kDa giảm xuống còn 3,38 kDa ở nồng độ 0,15 M, và 190,42 kDa xuống còn 3,46 kDa với nồng độ 0,4 M.
Ngoài ra có thể thấy khi tăng nồng độ axit ascorbic từ 0,05 M lên 0,4 M khả năng cắt mạch carrageenan của axit ascorbic trong thời gian 60 phút càng tăng, trọng lƣợng phân tử trung bình của mạch carrageenan sau thủy phân có xu hƣớng giảm chậm: ở nồng độ 0,05 M giảm còn 280,56 kDa và ở nồng độ 0,4 M giảm còn 190,42 kDa. Tuy nhiên khi thời gian thủy phân là 85 phút thì mạch carrageenan có trọng lƣợng phân tử trung bình giảm nhanh từ 53,24 kDa xuống còn 7,35 kDa khi tăng nồng độ axit từ 0,05 M lên 0,4 M.
Bảng 3.17. Trọng lƣợng phân tửtrung bình Mw(kDa) của oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa)
bằng axit ascorbic (C6H8O6) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 OC
Thời gian (phút) Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa)
0.05 M 0.15 M 0.4 M
60 280,56 219,04 190,42
85 53,24 9,71 7,35
Hình 3.8. PhổGPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC)
Hình 3.9. PhổGPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC)
Ngoài ra khi tăng nồng độ axit ascorbic trong cùng một thời gian 120 phút thì trọng lƣợng phân tử trung bình giảm không đáng kể: từ 6,6 kDa ở 0,05 M xuống còn 3,46 kDa ở nồng độ 0,4 M.
Khả năng cắt mạch kappa-carageenan của axit sulfuric đƣợc thể hiện
trong Bảng 3.18, kết quả xác định trọng lƣợng phân tử trung bình Mw cho
thấy ở cả ba nồng độ axit khác nhau 0,05; 0,15 và 0,4 M đều có sự thay đổi
Mw theo hƣớng giảm dần ở trong khoảng thời gian từ 60 đến 85 phút: từ
91,88 kDa giảm còn 22,25 kDa (giảm 75.78 %) ở 0,05 M, từ 43,06 kDa giảm xuống 8,98 kDa (giảm 79,15 %) ở 0,15 M và từ 35,46 kDa giảm xuống 7,41 kDa (giảm 79,10 %) ở nồng độ 0,4 M. Khi tăng thời gian thủy phân từ 85 lên 120 phút thì kết quả phân tích GPC của dịch sau thủy phân cho thấy trọng lƣợng phân tử trung bình tiếp tục có xu hƣớng giảm mạnh ở hai nồng độ khảo sát: ở nồng độ 0,05 M giảm 20,80 % (từ 22,25 kDa xuống 17,62 kDa), ở nồng độ 0,15 M giảm 53,66 % (từ 8,98 kDa giảm còn 4,16 kDa) và ở nồng độ 0,4 M giảm 37,75 % (từ 7,41 kDa giảm còn 4,61 kDa).
Nhƣ vậy có thể nhận thấy rằng trong khoảng thời gian thủy phân từ 60 đến 85 phút, phần trăm thay đổi về trọng lƣợng phân tử trung bình khi thủy phân bằng axit ascorbic 0,15 M là 95,57 % lớn hơn so với axit sulfuric 0,15 M (79,15 %)
Bảng 3.18. Trọng lƣợng phân tửtrung bình Mw (kDa) của oligocarrageenankhi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa) bằng axit sulfuric (H2SO4) ở nồng
độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 OC
Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa)
Thời gian (phút) 0,05 M 0,15 M 0,4 M 60 91,88 43,06 35,46 85 22,25 8,98 7,41 120 17,62 4,16 4,61 Nhận xét nội dung 3.4:
Kết quả xác định trọng lượng phân tử trung bình Mw bằng phổ GPC cho thấy khả năng cắt mạch carrageenan của hai loại axit hữu cơ và axit vô cơ. Với trọng lượng phân tử trung bình ban đầu của carrageenan là 454,5 kDa, axit ascorbic cắt mạch carrageenan hiệu quả trong khoảng thời gian 85
phút và làm giảm trọng lượng phân tử trung bình xuống còn 9,71 kDa ở nồng độ 0,15 M. Tương ứng với thời gian 85 phút, thủy phân bằng axit sulfuric tạo ra dịch oligo carrageenan có trọng lượng phân tử trung bình là 8,98 kDa ở nồng độ 0,15 M.
3.5. ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA OLIGO CARRAGEENAN
Để xác định đặc trƣng cấu trúc, oligo carrageenan đƣợc thu hồi từ dịch sau thủy phân bằng phƣơng pháp tủa cồn theo tỉ lệ dịch thủy phân:cồn 960 = 1:9, lọc và sấy khô oligo-carrageenan thu đƣợc ở nhiệt độ 60 0C. Kết quả phân
tích đặc trƣng cấu trúc carrageenan bằng phổ hồng ngoại IR đƣợc biểu diễn ở các Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.12.
Hình 3.11. Phổhồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC)
Hình 3.12. Phổhồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC)
Bảng 3.19. Một số dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tửvà các liên kết trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan [59]
Số sóng Cƣờng độ của loại
Loại dao động carrageenan
(cm-1) κ (kappa) ι (iota) 1210 - 1260 1010 -1080 928 - 933 840 - 850 820 - 830 810 - 820 800 - 805
Dao động hóa trị phản đối xứng (νas) của nhóm O=S=O Dao động của liên kết C-O-C
(liên kết glycosit) Dao động của liên kết C-O-C
(3,6-AnGal-2-Sulfate) Dao động của liên kết C-O-S
ở vị trí C4 trong D-Gal (Galactose)
Dao động của liên kết C-O-S
ở vị trí C2 trong D-Gal (Galactose)
Dao động của liên kết C-O-S
ở vị trí C6 trong D-Gal (Galactose)
Dao động của liên kết C-O-S
ởvị trí C2 trong AnGal (3,6-AnGal-2-Sulfate) Rất mạnh Rất mạnh Rất mạnh Rất mạnh Mạnh Mạnh Trung bình Trung bình
Không xuất Không xuất
hiện hiện
Không xuất Không xuất
hiện hiện
Không xuất Trung bình
hiện – Yếu
Phân tích các dao động đặc trƣng trên phổ hồng ngoại của oligo carrageenan cho phép nhận biết những nhóm chức chính có mặt trong cấu trúc phân tử của nó thể hiện ở vùng từ 1400 – 700 cm-1.
Trên phổ IR của mẫu carrageenan thấy xuất hiện vân phổ 1261 cm-1 với cƣờng độ mạnh chứng tỏ sự có mặt nhóm sulfat (O = S =O) trong mẫu và vân phổ cho biết vị trí của nhóm sulfat đó trong vòng galactose pyranose.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại có thể phân biệt đƣợc liên kết glycoside C-O với liên kết anhydro C-O: dao động của liên kết glycoside giữa vòng galactose pyranose với vòng 3,6 anhydro galactose đƣợc nhận biết thông qua vân phổ tại 1038 cm-1, và mẫu carrageenan cho thấy xuất hiện của vòng 3,6 anhydro galactose đƣợc đặc trƣng bởi dao động của liên kết anhydro C-O
với số sóng tƣơng ứng là 928 cm-1 (đây là vân phổ đặc trƣng chỉ có ở hai loại κ-carrageenan và ι-carrageenan) [60].
Một điểm quan trọng của phổ hồng ngoại trong việc xác định cấu trúc hóa học của carrageenan là có thể phân biệt đƣợc vị trí của nhóm thế sunphat trên vòng galactose thông qua liên kết S-O, từ đó có thể nhận biết loại của carrageenan. Liên kết S-O ở các vị trí C khác nhau trên vòng galactose sẽ cho dải hấp thụ tại các số sóng khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
-Trên phổ IR xuất hiện dao động của liên kết C4-O-S của nhóm sunphat tại vị trí axial trên C4 thể hiện qua dải hấp thụ tại tần số 847 và 704 cm-1, đây là các vân phổ đặc trƣng cho kiểu κ-carrageenan [59].
-Các dải hấp thụ tại 810 - 830 cm-1 (ứng với liên kết OSO3 tại C2 và C6 của vòng galactose pyranose, là vân phổ đặc trƣng cho các cấu trúc µ-, ν- và λ-carrageenan) không thấy xuất hiện trên phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan thu đƣợc, một lần nữa điều này chứng tỏ mẫu carrageenan nghiên cứu có thể là kiểu kappa (κ-) hoặc iota (ι-).
Một vân phổ đặc trƣng khác có thể phân biệt cấu trúc của carrageenan là kiểu kappa hay iota, đó chính là vân phổ tại vùng 805 cm-1, đặc trƣng cho liên kết O-SO3 tại C2 của vòng 3,6 anhydro galactose pyranose của ι- carrageenan. Trên kết quả phân tích, dải hấp thụ tại vùng này không xuất hiện trên phổ IR.
Nhƣ vậy, từ dữ liệu trên có thể khẳng định rằng mẫu carrageenan chiết từ rong K.alvarezii là loại κ-carrageenan.
Đối với kết quả phân tích phổ hồng ngoại của oligo carrageenan, sau khi thủy phân carrageenan bằng axit ascorbic, mẫu oligo carrageenan đƣợc tạo ra vẫn còn các nhóm chức đặc trƣng của carrageenan (hình 3.11), trong khi đó với mẫu oligo carrageenan thủy phân bằng axit sulfuric thì các nhóm chức đã có sự dịch chuyển các bƣớc sóng, đặc trƣng liên kết anhydro ở số
sóng 928 -933 cm-1 không còn xuất hiện (hình 3.12). Nhƣ vậy có thể thấy
thủy phân carrageenan bằng axit ascorbic ở nồng độ 0,15 M, nhiệt độ 90 0C trong thời gian 85 phút không làm thay đổi cấu trúc của carrageenan.
3.6. KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG CỦA DỊCH OLIGOCARRAGEENAN TRÊN CÂY NGÔ CARRAGEENAN TRÊN CÂY NGÔ
Với khả năng kích thích sinh trƣởng của dịch oligo carrageenan có trọng lƣợng phân tử trung bình là 10 kDa trên cây trồng [10]; luận văn này lựa chọn những dịch sau thủy phân có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng 8 – 10 kDa để thử nghiệm khả năng kích thích sinh trƣởng. Tính chất dịch chiết oligo carrgeenan đƣợc chọn sử dụng làm phân bón lá đƣợc trình bày ở bảng
3.20: