Năm 2016, dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại 07 xã, phường của 06 huyện, thị xã thuộc 03 tỉnh, thành phố. Số gia cầm mắc bệnh là 4.767 con, số tiêu huỷ là 6.182 con. Dịch Cúm gia cầm A/H5N6 xảy ra tại 07 xã, phường của 06 huyện, thị xã thuộc 05 tỉnh, thành phố; số gia cầm mắc bệnh là 5.189 con; số gia cầm tiêu huỷ là 13.550 con, bao gồm cả gia cầm khỏe mạnh trong cùng đàn mắc bệnh (gà chiếm 91,90% trong tổng số chết, vịt chiếm 8,10%) (Cục Thú y, 2016).
Trong năm 2017, toàn quốc đã xảy ra 34 ổ dịch cúm A/H5N1 tại 27 huyện thuộc 17 tỉnh, thành phố; số gia cầm mắc bệnh là 39.636 con, tiêu hủy là 56.125 con. Xảy ra 06 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 05 huyện thuộc 05 tỉnh với số gia cầm mắc bệnh là 10.680 con, số gia cầm tiêu hủy là 17.710 con (Cục Thú y, 2017).
Năm 2018, đã xảy ra 07 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 07 hộ chăn nuôi gia cầm thuộc 05 tỉnh, thành phố với 23.958 con gia cầm phải tiêu hủy. So với năm 2017, số hộ chăn ni gia cầm có dịch giảm 12 lần, số xã có dịch giảm 6 lần, số tỉnh có dịch giảm 4 lần; số gia cầm mắc bệnh và tiêu hủy giảm 3 lần (Cục Thú y, 2018).
Hình 2.5. Biểu đồ so sánh tình hình cúm gia cầm trên cả nước 6 tháng đầu năm 2018 và 6 tháng đầu năm 2019
1 11 1 13 1 13 0 2 4 6 8 10 12 14
06 tháng đầu năm 2018 06 tháng đầu năm 2019
Số đ ịa p h ư ơ n g có d ịc h b ện h Số tỉnh có dịch Số huyện có dịch Số xã có dịch
15
Hình 2.6. Biểu đồ so sánh số lượng gia cầm mắc cúm 6 tháng đầu năm 2018 và 6 tháng đầu năm 2019
Trong 06 tháng đầu năm 2019, đã có 13 ổ dịch cúm gia cầm xảy ra tại 13 huyện của 11 tỉnh, thành phố (Quảng Ninh, Cao Bằng, Hà Nội, Nghệ An, Khánh Hòa, Kon Tum, Đắk Lắk, Long An, Trà Vinh, Vĩnh Long, Hậu Giang), buộc tiêu hủy là 23.871 con gia cầm (Cục Thú y, 2019).
Từ năm 2015 tới 6 tháng đầu năm 2019 cả nước không ghi nhận ca bệnh Cúm A/H5N1 trên người.
Thời gian xảy ra các ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 và A/H5N6 thường tập trung vào các tháng cuối năm và kéo dài tới các tháng đầu năm đặc biệt thường tập trung vào dịp Tết nguyên đán. Điều này cũng phù hợp với thực tế tại nước ta đây là giai đoạn chuyển mùa, thời tiết thuận lợi; hoạt động chăn nuôi, vận chuyển buôn bán gia cầm diễn nhộn nhịp để phục vụ nhu cầu thịt gia cầm rất cao của người dân trong dịp Tết đã tạo điều kiện lý tưởng cho mầm bệnh phát triển và lây lan.
Các ổ dịch thường tập trung chủ yếu tại các tỉnh thuộc 3 vùng đồng bằng lớn của cả nước là đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh duyên hải miền Trung và các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng Sơng Cửu Long. Điều này cũng hồn tồn phù hợp với đặc điểm đây là những vùng có tổng đàn gia cầm lớn, mật độ chăn nuôi gia cầm rất cao, hoạt động buôn bán, vận chuyển gia cầm và các sản phẩm gia cầm
3,000 23,871 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
06 tháng đầu năm 2018 06 tháng đầu năm 2019
Tổ n g số c o n m ắc b ện h
rất nhộn nhịp, tình trạng bn bán gia cầm nhập lậu qua biên giới tại các tỉnh phía Bắc, hoạt động nuôi vịt chạy đồng tại các tỉnh phía Nam do đó có nhiều cơ hội thuận lợi cho virus cúm phát tán và lây bệnh cho gia cầm.
2.4. CĂN BỆNH
Cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm, do nhóm virus cúm typ A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA. Nhóm virus cúm A có 16 subtyp HA (từ H1 đến H16) và 9 subtyp NA (từ N1 đến N9). Gia cầm, thủy cầm là nguồn lưu trữ mầm bệnh chủ yếu trong tự nhiên. Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau.
Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu về cúm gia cầm, các nhà khoa học đã cơng bố, nhóm virus cúm A có thêm 2 subtype HA (H17-H18) và 2 subtype NA (N10-N11), các chủng virus cúm A/H17N10 và H18N11 được phát hiện trên loài dơi Peruvian (Tong et al, 2013).
Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là: nhóm virus cúm A (Influenza A), nhóm virus cúm B (Influenza B), nhóm virus cúm C (Influenza C) và nhóm Thogotovirrus. Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF) và ở Thogotovirrus là Glycoprotein (GP) (Ito et al., 1998; Murphy and Webster, 1996).
2.4.1. Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm
Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A qua kính hiển vi điện tử có dạng hình khối trịn, hình trứng hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 - 120 nm. Virus có vỏ bọc ngồi, phân tử lượng của hạt virus khoảng 250 triệu Da.
Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhơ ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường glycoprotein gồm: HA, NA, M1 (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender et
al., 1999; Zhao et al., 2008). Có sự phân bố khơng đồng đều giữa các phân tử
NA và HA (tỷ lệ NA:HA khoảng 1:4), đây là 2 loại protein kháng nguyên có vai trị quan trọng trong q trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy and Webster, 1996; Uiprasertkul et al., 2007).
17
Hình 2.7. Cấu trúc bên ngồi của virus cúm gia cầm
Nguồn: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html
Hệ gen của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (Negative single strain RNA - (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành 1 sợi duy nhất bên trong vỏ capsid, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007).
Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein
enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerasa của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus. Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính tốn khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 87,103 Da) (Murphy và Webster, 1996). Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể lồi vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 400C, cịn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 370C) (Subbarao et al., 1998).
Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp
enzyme PB1- tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme promerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996). Gần đây, đã có phát hiện thêm 1 protein (PB1-F2) được mã hóa bởi 1 khung đọc mở khác nhau của PB1, có vai trị gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào chết theo chương trình) (Tumpey et al., 2002).
Phân đoạn 3 (gen PA) kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao,
khoảng 83000 Da (trên thực tế là 96.103 Da). PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus (Luong and Palese, 1992).
Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A.
Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt cắt của enzyme protease, đây là vùng quyết định độc lực của virus (Bosch et al., 1981; Gambotto
et al., 2008). Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu khơng
được oxy hóa) và 77.103 Da (nếu được oxy hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da và HA2 là 29.103 Da) (Keawcharoen et al., 2005; Luong and Palese, 1992).
Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp
nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ.
Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài
thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) (Lê Thanh Hịa, 2004). Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Daton.
Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước 1027 bp mã hóa cho protein đệm
(matrix protein - M) của virus. Có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus. Protein M1 là protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình "nảy chồi" của virus. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử là 11.103 Da, là protein chuyển màng - kênh ion cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus, trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Luong and Palese, 1993; Murphy and Webster, 1996; Basler, 2007).
Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein khơng cấu trúc (non structural
protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen mã của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2, có vai trị bảo vệ hệ gen của virus.
19
khơng có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi tính kháng ngun tạo nên chủng virus cúm A mới (Suarez and Schultz-Cherry, 2000).
Hình 2.8. Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A
Nguồn: Murphy and Webster (1996)
2.4.2. Cấu trúc, chức năng của Protein Hemagglutinin và Neuraminidase
2.4.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)
Protein HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (David, 1999) có vai trị đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Gen mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (invitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 subtype HA đã được phát hiện (H1 - H16). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus có vai trị quan trọng trong q trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender et al., 1999; Wagner et al., 2002). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ 2 tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2
(27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981; Wagner et al., 2002).
Trên phân tử HA có 2 vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C. Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc aminoacid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử phân tử protein trên vỏ virus (David, 1999). Sự biến đổi trong gen mã hóa cho gen kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hàng năm.
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình khơng gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002). Vị trí acid amin 226 (aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm. Ngoài ra, một số vị trí acid amin khác: Glutamine 222, Glycine 224 cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong and Palese, 1993).
Gen HA bao gồm hai đoạn HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho một dãy các aminoacid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của Protease. Đây là vùng quyết định độc lực hay tính gây bệnh của của virus. Phân tử HA1, HA2 bộc lộ ra ngồi màng và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm.
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí các aminoacid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi
21
là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA. Protein HA kích thích cơ thể sản sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hịa virus. Vì thế, protein HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích đến của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Bosch et al., 1998).
Chuỗi Oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng, chuỗi này chứa một số aminoacid mang tính kiềm (basic aminoacid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (David, 1999). Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng phân cắt HA càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúmA (Wolfgang Garten, 2008)
Mức độ gây bệnh của virus cúm A cịn phụ thc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid. Virus cúm A khơng có gen tổng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus. Càng có nhiều điểm cắt protease hồn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà mặng nề hơn (Wolfgang Garten, 2008).
2.4.2.2. Protein NA (Neuraminidase)
Protein Neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C3.2.1) là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Uiprasertkul et al., 2007).
Protein Neuraminidase có 3 chức năng chính:
Protein NA có vai trị là một enzyme cắt đứt liên kết giữa các gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể