2.4.2.1. Protein HA (Hemagglutinin)
Protein HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (David, 1999) có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus. Gen mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (invitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 subtype HA đã được phát hiện (H1 - H16). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender et al., 1999; Wagner et al., 2002). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ 2 tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2
(27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích (Bosch et al., 1981; Wagner et al., 2002).
Trên phân tử HA có 2 vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C. Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc aminoacid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử phân tử protein trên vỏ virus (David, 1999). Sự biến đổi trong gen mã hóa cho gen kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hàng năm.
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002). Vị trí acid amin 226 (aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm. Ngoài ra, một số vị trí acid amin khác: Glutamine 222, Glycine 224 cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong and Palese, 1993).
Gen HA bao gồm hai đoạn HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho một dãy các aminoacid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của Protease. Đây là vùng quyết định độc lực hay tính gây bệnh của của virus. Phân tử HA1, HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm.
Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí các aminoacid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi
21
là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA. Protein HA kích thích cơ thể sản sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. Vì thế, protein HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích đến của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Bosch et al., 1998).
Chuỗi Oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng, chuỗi này chứa một số aminoacid mang tính kiềm (basic aminoacid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type. Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (David, 1999). Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng phân cắt HA càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúmA (Wolfgang Garten, 2008)
Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuôc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid. Virus cúm A không có gen tổng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus. Càng có nhiều điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà mặng nề hơn (Wolfgang Garten, 2008).
2.4.2.2. Protein NA (Neuraminidase)
Protein Neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C3.2.1) là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA. Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng và phần kị nước gắn vào vỏ capsid (Uiprasertkul et al., 2007).
Protein Neuraminidase có 3 chức năng chính:
Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa các gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp các hạt virus mới trên màng tế bào. Virus cần phải có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của biểu mô hô hấp.
Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus nhanh hơn (Uiprasertkul et al., 2007).
NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu.
Virus cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp. Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua màng nhầy do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích. Mặt khác, NA có khả năng phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúm và viêm phổi kế phát do vi khuẩn. Đột biến trong gen NA làm thay đổi những hoạt tính của enzyme này (Cohen et al., 2013)
Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virrus không đặc hiệu hiện nay (Aoki et al., 2007).
Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA. Sự đột biến trượt xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến hóa là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA và đã được chứng minh rằng thông qua loại hình đột biến xóa gen này, virus cúm A/H5N1 sẽ tạo nên một subtype N mới có độc lực cao hơn (Cohen et al., 2013).
Như vậy kháng nguyên HA và NA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế truyền lây sang người.
2.4.2.3. Các phương thức biến đổi kháng nguyên
a. Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus. Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc,
23
không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thế “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt-xóa) một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus (Lê Thanh Hòa và cs., 2006). Tùy thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm). Tần xuất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác (Wagner et al., 2002).
Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới hoặc làm thay đổi cấu trúc, thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko et al., 2008).
b. Hiện tượng glycosyl hóa
Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbohydrate (oligosaccharide) vào với amino acid Asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA và NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = amino acid bất kỳ, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine). Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điển hình thành bộ mã của Asparagine tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, làm cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hòa sự nhân lên của virus (Baigent và Mc Cauley, 2001).
Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng trộn kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau. Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh được cho người và rất có thể A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở
người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống dịch (Baigent và Mc Cauley, 2001).
c. Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tương trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm và rất ít ở một số virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào có thể xảy ra sự hòa trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của 2 chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Chen et al., 2006).