3.1.1. Đối tượng
Virus cúm A/H9N2 trong các mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà; mẫu môi trường (mẫu phân tươi, chất thải trên chuồng, lồng nhốt gia cầm; mẫu tại khu vực giết mổ; mẫu tại khu vực chứa rác thải).
3.1.2. Địa điểm
Thực hiện lẫy mẫu tại 05 chợ buôn bán gia cầm sống ở tỉnh Bắc Ninh (các chợ Thị Cầu, Chợ Đọ, Chợ Gà) và thành phố Hà Nội (các chợ Hà Vỹ, chợ Ngũ Hiệp).
Các chợ được lựa chọn căn cứ trên kết quả dương tính với virus cúm gia cầm đã được thực hiện bởi Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương (National Centre for Veterinary Diagnostics - NCVD) và Cục Thú y (Department of Animal Health) trong chương trình giám sát cúm gia cầm - do FAO tài trợ. Mỗi chợ được chọn phải có hoạt động buôn bán gia cầm sống diễn ra liên tục 7 ngày/tuần và có tối thiểu 10 hộ cá thể tham gia buôn bán gia cầm.
3.1.3. Thời gian
Thực hiện lấy mẫu và xử lý, xét nghiệm mẫu từ tháng 10/2017 đến tháng 3/2018.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
(i) Tình hình chăn nuôi, tiêm phòng và dịch bệnh cúm gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015 - 2018.
(ii) Giám sát lưu hành virus cúm A/H9N2 tại các chợ. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu. - Xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H9 trong các mẫu. - Xác định sự lưu hành virus cúm A/H9N2 tại các chợ lấy mẫu.
(iii) Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên HA, NA của một số chủng dương tính cúm A/H9N2
- Phân tích, so sánh sự tương đồng về nucleotide của gen HA và NA với chủng tham chiếu;
35
- Xác định mối quan hệ phả hệ của chủng nghiên cứu với chủng tham chiếu và các chủng đăng ký trong ngân hàng gen.
(iv) Đánh giá một số yếu tố nguy cơ có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm virus cúm A tại địa bàn nghiên cứu.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Mẫu thí nghiệm 3.3.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu dịch ngoáy hầu họng của gà và mẫu môi trường tại 05 chợ đã được lựa chọn.
3.3.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất lấy mẫu
3.3.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy Realtime PCR: Biorad IQ5
- Máy ly tâm lạnh ZK306, máy ly tâm lạnh Hettick - Máy votex, spin
- Buồng cấy an toàn sinh học cấp II -ESCO - Buồng cấy an toàn sinh học cấp I
- Máy triết tách mẫu tự động TACO - Tủ lạnh -200C, -800C
- Micropipet các cỡ, Multisepper và đầu típ phù hợp; ống eppendorf có thể tích khác nhau.
- Bảo hộ lao động, tăm bông vô trùng, ống đựng mẫu, thùng bảo quản mẫu, nhãn dán mẫu, phiếu ghi thông tin, túi đựng mẫu, thuốc sát trùng, găng tay,...
3.3.2.2. Hóa chất
- Môi trường bảo quản mẫu: Môi trường PBS - Glycerol, được pha theo công thức sau:
+ Pha hỗn hợp PBS và Glycerol theo tỷ lệ 1:1
+ Bổ sung kháng sinh vào 1l môi trường PBS/Glycerol Benzylpenicillin: 2*106IU/l
Streptomycine: 200mg/l Gentamycine: 250mg/l
- Bộ kít chiết tách TACO DNA/RNA EXTRACTION KIT
- Bộ kít dùng cho phản ứng realtime RT-PCR: SuperScript III One step qRT-PCR (Cat No.11732-020)
- Bộ kít dùng cho phản ứng RT-PCR: SuperScript III One step RT-PCR (Cat No. 12574-026)
- Cồn Ethanol tuyệt đối-Merk
- Đối chứng dương tính (+), đối chứng âm tính (-) H9N2 - Đoạn mồi (primers) và Đoạn dò (probe) để phát hiện virus, - Đoạn mồi dùng để giải trình tự gen HA.
Bảng 3.1. Trình tự đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H9N2 Kí hiệu
probe/primers Trình tự (5'-3')
Probe FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-BHQ1
M-5 forward AGATGAGYCTTCTAACCGAGGTCG
M-5 reverse TGCAAANACATCYTCAAGTCTCTG
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích
Dùng phương pháp điều tra hồi cứu (Nguyễn Như Thanh, 2015) về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến của dịch cúm gia cầm và thực trạng công tác tiêm phòng cúm gia cầm tại thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh giai đoạn 2015 - 2018.
Phương pháp phỏng vấn trực tiếp người bán - chủ gia cầm được chọn lấy mẫu - theo bảng câu hỏi được thiết kế sẵn (phụ lục) về các hoạt động liên quan đến tình hình buôn bán gia cầm gần đây. Bảng câu hỏi từ mỗi hộ buôn bán đều được lưu theo mã thống nhất với mã của mẫu tương ứng.
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu bệnh phẩm được lấy, bao gói và bảo quản theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT được ban hành theo Thông tư số 71/2011/TT- BNNPTNT ngày 25/10/2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
37
3.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu dịch ngoáy hầu họng
Dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong hầu họng của gà ngoáy nhẹ nhàng trên bề mặt niêm mạc.
Mẫu được thu thập tại mỗi chợ trong 7 ngày liên tục; 10 hộ bán gia cầm đầu tiên đến chợ có tối thiểu 5 gà/hộ sẽ được chọn để lấy mẫu. Mẫu lấy từ dịch ngoáy hầu họng của 5 gà sẽ được tính là 1 mẫu gộp của hộ đó. Gộp mẫu được thực hiện ngay tại chợ trong ống chứa 2 ml dung dịch nuôi, đưa vào thùng bảo quản lạnh ở 40C rồi vận chuyển về phòng thí nghiệm tại NCVD, lưu giữ ở -700C cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu môi trường
Mẫu môi trường được lấy bằng cách dùng tăm bông vô trùng tại 3 khu vực khác nhau có liên quan đến khu vực môi trường diễn ra hoạt động mua bán - giết mổ gia cầm.
Các vị trí lấy mẫu môi trường là những vị trí được đề nghị bởi Indriani et al. (2010) về chương trình quản lý thường quy và giám sát lưu hành cúm gia cầm tại các chợ buôn bán gia cầm sống. Bao gồm:
- Khu vực nhốt gia cầm (bao gồm chuồng, lồng… nhốt, chứa gia cầm trong thời gian diễn ra hoạt động buôn bán).
- Khu vực diễn ra hoạt động giết mổ (bao gồm cả dụng cụ giết mổ);
- Khu vực chứa chất thải (bao gồm thùng rác chứa lông và các phần bỏ đi khác sau giết mổ);
Mỗi ngày, ba mẫu môi trường được lấy riêng từ 3 khu vực được đề cập trên và được tính thành 1 mẫu gộp của chợ đó trong 1 ngày.
Mẫu được bảo quản trong dung dịch nuôi và được vận chuyển lạnh về NCVD, Hà Nội. Mẫu được lưu giữ ở -700C cho các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H9N2
Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H9N2 bằng kỹ thuật Realtime RT- qPCR được tiến hành theo quy trình chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm quy định tại Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8400-26:2014, cụ thể theo các bước tóm tắt sau:
- Xử lý mẫu bệnh phẩm:
- Chuẩn bị Master mix theo tỷ lệ dưới đây:
Hỗn hợp phản ứng
(Kít Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR Kit)
Lượng cho 01 phản ứng, µl 2X Reaction buffer 12.5 Mồi xuôi 20 μM 0.5 Mồi ngược 20 μM 0.5 Taqman probe 6 μM 0.5 Enzyme mix 0.5 Nước cất sạch nuclease 5.5 Mẫu RNA 5 Tổng 25
- Tiến hành nhân gen theo chu trình nhiệt sau:
Nhiệt độ Thời gian/chu kỳ
500C 15 phút
950C 2 phút
950C 10 giây/40 chu kỳ
600C 30 giây
Chu trình nhiệt được tối ưu hóa theo hướng dẫn sử dụng của bộ kít. (Cat No.11732-020).
Hình 3.1. Quy
Đọc kết quả
Điều kiện phản ứ trước) có giá trị Ct (± 2 C
Với điều kiện như không có Ct là âm tính.
39
. Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A
ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương (± 2 Ct, mẫu đối chứng âm tính không có giá t
như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là d tính. Mẫu có giá trị 35< Ct ≤ 40 được coi là ng
cúm A/H9N2
dương (được chuẩn độ ó giá trị Ct).
oi là dương tính. Mẫu i là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định.
3.4.4. Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA
- Xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm gia cầm type A/H9N2 lưu hành bằng kỹ thuật giải trình tự và phân tích trình gene HA.
Để giải trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A/H9N2, chúng tôi sử dụng cặp primer đặc hiệu để thực hiện khuếch đại bằng phương pháp RT- PCR. Phản ứng sử dụng bộ kit Invitrogen Superscript III Platinum One step qRT- PCR Kit - Mỹ theo đúng quy trình hướng dẫn bởi nhà sản xuất.
Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp điện di trên thạch 2%. Sản phẩm khuếch đại của đoạn gene HA1 và HA2 có kích thước 1100bp và 1000bp. Chọn những mẫu có sản phẩm khuếch đại đoạn gen HA1 và HA2 đúng kích thước theo thiết kế gửi đi Công ty Macrogen, Hàn Quốc giải trình tự gen.
Các chuỗi trình tự đoạn gene HA của virus cúm gia cầm type A/H9N2 được xử lý và phân tích bằng phần mềm Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 6.0; Tamura et al., 2013). Tiến hành liên kết, so sánh với các chủng tham chiếu từ ngân hàng gene bằng chức năng liên kết (Alignment by ClustalW) và xác định phân nhóm virus cúm gia cầm type A/H9N2 bằng phương pháp kết nối liền kề (Neighbor-Joining method) với hệ số Bootstap 1.000 lần lặp lại.
3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả xét nghiệm được nhập và xử lý qua MS. Excel, phần mềm SAS 9.0, như sau:
- Phân tích các yếu tố nguy cơ: Theo phương pháp nghiên cứu bệnh - chứng (Nguyễn Như Thanh, 2015)
Sử dụng bảng tương liên (2x2) để phân tích
Có bệnh Không có bệnh Tổng
Phơi nhiễm a b Hàng 1 (H1)
Không phơi nhiễm c d Hàng 2 (H2)
41
+ Tính tỷ suất chênh lệch OR (Odd Ratio):
OR = =
Trong đó chọn đối tượng quy định như sau:
+ Những mẫu dương tính với virus cúm A: Mẫu dương + Những mẫu âm tính với virus cúm A: Mẫu âm
a: nhóm bệnh có phơi nhiễm
b: nhóm không bệnh có phơi nhiễm c: nhóm bệnh nhưng không phơi nhiễm d: nhóm không bệnh và không phơi nhiễm
Nếu OR (Odds ration) = 1: Không có ảnh hưởng, khác nhau giữa 2 nhóm + OR > 1: Nguy cơ tăng
+ OR <1 : Nguy cơ giảm (khi đối tượng nghiên cứu được bảo vệ).
- Tính tỷ lệ dương tính xét nghiệm (tỷ lệ nhiễm p) tính theo công thức:
p = a
nx 100
trong đó: a là số mẫu dương tính; n là tổng số mẫu xét nghiệm.
Ước tính tỷ lệ nhiễm trong quần thể (P) với độ tin cậy 95% được theo công thức:
P = p ± 1,96 x SE
trong đó SE là sai số chuẩn được tính theo công thức:
= . (1 − )/
+ Nếu giá trị xác suất P<0,05 thì nghiên cứu có ý nghĩa thống kê
+ Nếu giá trị xác suất P>0,05 thì nghiên cứu không có ý nghĩa thống kê, chưa tìm ra mối liên quan giữa yếu tố nguy cơ với việc mẫu dương tính virus cúm A.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI, TIÊM PHÒNG VÀ DỊCH BỆNH CÚM GIA CẦM TẠI HÀ NỘI VÀ BẮC NINH GIAI ĐOẠN 2015-2018 CẦM TẠI HÀ NỘI VÀ BẮC NINH GIAI ĐOẠN 2015-2018
4.1.1. Tình hình chăn nuôi gia càm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gia cầm được Nhà nước quan tâm và phát triển cả về số lượng và chất lượng. Chăn nuôi gia cầm nói chung và chăn nuôi gà nói riêng được coi là điểm mạnh của Việt Nam. Chăn nuôi gia cầm chiếm một vị trí quan trọng trong chương trình cung cấp protein động vật cho con người. Gia cầm chiếm 20-25% tổng sản lượng thịt. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, năm 2018 cả nước có khoảng 408,97 triệu con gia cầm các loại (riêng đàn gà khoảng 316,91 triệu con = 77,5% tổng đàn gia cầm) trong đó tập trung tại các tỉnh đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng Sông Cửu Long, cung cấp phần lớn sản lượng thịt và trứng phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ trong nước. Đàn gia cầm liên tục tăng và phương thức chăn nuôi cũng có một bước dịch chuyển lớn từ chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ tự cung, tự cấp sang chăn nuôi theo hướng trang trại công nghiệp, hàng hóa, tập trung. Nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đã được áp dụng vào chăn nuôi gia cầm nhằm nâng cao năng suất, chất lượng của trứng, thịt đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và hướng tới xuất khẩu. Cũng không nằm ngoài xu thế đó, tại các tỉnh Bắc Ninh và thành phố Hà Nội chăn nuôi gia cầm cũng đang nhận được sự quan tâm của chính quyền các cấp và sự đầu tư của các tập đoàn kinh tế. Tình hình chăn nuôi gia cầm tại các tỉnh này từ 2015 đến 2018 được thể hiện qua bảng 4.1.
Dưới bảng 4.1 cho thấy:
Trong giai đoạn 2015 đến 2018, tổng đàn gia cầm tại thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh có tăng trưởng đều qua các năm do đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường và sự ổn định về tình hình dịch bệnh, đó là kết quả của sự vào cuộc đồng bộ của các cấp, các ngành và các nhà khoa học, các doanh nghiệp và sự đầu tư của người chăn. Tuy nhiên ngoài một số trang trại công nghiệp được đầu tư kỹ thuật tốt thì phương thức chăn nuôi tại các địa phương nay đa số vẫn là chăn nuôi nhỏ lẻ, tận dụng thức ăn, phụ phẩm nông nghiệp. Tình hình chăn nuôi, phương thức chăn nuôi tại các tỉnh, thành phố cụ thể như sau:
43
Bảng 4.1. Kết quả thống kê đàn gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 (nghìn con)
Năm Tỉnh, thành Gà Vịt Gia cầm khác Tổng 2015 Hà Nội 16.540 4.652 609 21.801 Bắc Ninh 3.682,6 768,8 252,9 4.704,3 2016 Hà Nội 17.191 4.911,5 641,8 22.744,3 Bắc Ninh 3.750,8 786,2 255,9 4.792,9 2017 Hà Nội 18.465 5.358 578 24.401 Bắc Ninh 4.037 803 260 5.100 2018 Hà Nội 19.426 5.579 615 25.620 Bắc Ninh 4.228 811 262 5.301
Tại Hà Nội: Tổng đàn gia cầm trong các năm dao động trong khoảng 21,8- 25,6 triệu con, trong đó đàn gà chiếm tỷ lệ 75,6-76,4%, tiếp đó là đàn vịt với tỷ lệ 20,8-21,9%, các loại gia cầm khác chiếm tỷ lệ 2,4-2,8%. Đến hết năm 2018, trên địa bàn thành phố có 290 công ty, xí nghiệp, hợp tác xã, trung tâm, doanh nghiệp chăn nuôi gia cầm chiếm khoảng 8% tổng đàn, còn lại là hình thức nuôi gia trại, chăn nuôi nông hộ, nhỏ lẻ với trên 134.000 hộ, cơ sở chăn nuôi, chiếm 92% tổng đàn gia cầm. Trên địa bàn thành phố có 340 cơ sở ấp nở gia cầm, thủy cầm gồm 116 cơ sở công nghiệp và 224 cơ sở thủ công (Chi cục Chăn nuôi và Thú y Hà Nội, 2019).
Tại Bắc Ninh: Tổng đàn gia cầm trong các năm dao động trong khoảng 4,7 - 5,3 triệu con, trong đó đàn gà chiếm tỷ lệ 78,1 - 79,8%, tiếp đó là đàn vịt chiếm tỷ lệ 15,3 - 16,4%, các loại gia cầm khác chiếm tỷ lệ 5,3 - 7,6%. Năm 2018, trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh có 60 trang trại chăn nuôi gia cầm, 10 cơ sở chuyên sản xuất giống gà với hơn 389.500 con gà bố mẹ (trong đó Công ty TNHH MTV gà giống DABACO thuộc Công ty CP tập đoàn DABACO Việt Nam có 350.000 con). Các cơ sở giống gia cầm trên địa bàn tỉnh đã thường xuyên chọn lọc, nhập mua các giống gia cầm bố mẹ có năng suất, chất lượng cao từ nước ngoài hoặc các Trung tâm giống trong nước về nuôi để sản xuất con giống phục vụ người chăn nuôi trong, ngoài tỉnh (Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Ninh, 2019).
Thành phố Hà Nội có nhu cầu tiêu dùng thực phẩm có nguồn gốc từ động vật rất lớn, trung bình 600 - 700 tấn/ngày, trong đó tỷ lệ thịt gia cầm chiếm 30%, trong khi thành phố mới tự cung cấp được 60%, còn lại nhập từ các tỉnh khác hoặc nhập khẩu; giết mổ gia cầm chủ yếu nhỏ lẻ trong chợ buôn bán gia cầm hoặc ngay trong khu dân cư. Thành phố Hà Nội có chợ gia cầm Hà Vỹ (huyện Thường Tín), là nơi tập trung và tiêu thụ một lượng lớn gia