tĩnh mạch Thời gian theo dõi Ct trung bình gà sống sót Mức độ bài thải virus Ct trung bình gà chết Mức độ bài thải virus Ngày 1 27,85 ++ 18,6 ++++ Ngày 2 23,24 +++ 20,1 +++ Ngày 3 19,56 ++++
Qua bảng 4.2 có thể thấy cả gà chết và gà sống sót đều bài thải một lƣợng rất lớn virus ra môi trƣờng, gà chết lấy mẫu swab hầu họng kiểm tra thấy lƣợng virus bài thải cao hơn so với gà sống sót tại thời điểm lấy mẫu.
Theo qui định về phân loại cúm gia cầm của OIE Virus có chỉ số IVPI đạt cao hơn 1,2 là thuộc nhóm virus cúm có độc lực cao. Nhƣ vậy virus
A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) có độc lực cao với gà khi
tiêm tĩnh mạch với liều 106TCID50/100µ/con. Virus gây chết 100% gà thí nghiệm trong 52 giờ sau khi tiêm. Gà ốm và chết có biểu hiện bệnh rõ, mổ khám thấy bệnh tích điển hình của bệnh cúm gia cầm nhƣ phổi viêm, phù và xuất huyết ; xuất huyết mỡ vành tim. Kết quả kiểm tra rRT-PCR mẫu phổi dƣơng tính virus H5N6.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu độc lực của virus cúm A/H5N6 clade 2.3.4.4B bằng phƣơng pháp công cƣờng độc qua đƣờng nhỏ mũi bằng phƣơng pháp công cƣờng độc qua đƣờng nhỏ mũi
Thử nghiệm đánh giá độc lực của virus H5N6 bằng phƣơng pháp nhỏ mũi với liều 106 TCID50/100 ul/con.Theo dõi gà thí nghiệm trong 10 ngày liên tiếp và chấm điểm lâm sàng 2 lô gà thí nghiệm và đối chứng. Lấy mẫu swab hầu họng
và swab hậu môn mỗi ngày sau công để xét nghiệm kiểm tra lƣợng virus bài thải. Kết quả theo dõi lâm sàng gà công cƣờng độc đƣợc thể hiện qua bảng 4.3
Bảng 4.6. Kết quả theo dõi lâm sàng gà công cƣờng độc virus qua đƣờng nhỏ mũi Ký hiệu gà HGK T (log2)
Theo dõi triệu chứng lâm sàng sau công Bài thải virus
Ngày sau công cƣờng độc Điể
m lâm sàng Tỷ lệ chết Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 trƣớc công 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 G1 - nhỏ mũi PBS 0 0,00 0% 40,00 40,00 40,00 40,00 1 302 0 0,00 40,00 40,00 40,00 40,00 2 304 0 0,00 40,00 40,00 40,00 40,00 3 306 0 0,00 40,00 40,00 40,00 40,00 4 309 0 0,00 40,00 40,00 40,00 40,00 5 310 0 0,00 40,00 40,00 40,00 40,00 G2 - nhỏ mũi virus 0 2,29 100 % 38,61 31,65 24,78 19,92 1 419 0 1 3 3 3 3 3 3 3 2,20 40,00 32,32 26,45 17,02 2 422 0 3 3 3 3 3 3 3 3 2,40 36,54 28,46 21,40 3 423 0 2 3 3 3 3 3 3 3 2,30 40,00 32,54 30,11 19,70 4 434 0 3 3 3 3 3 3 3 3 2,40 39,10 26,66 18,92 5 437 0 1 3 3 3 3 3 3 3 2,20 35,33 35,48 29,76 24,22 6 446 0 1 3 3 3 3 3 3 3 2,20 40,00 34,12 26,84 20,58 7 467 0 3 3 3 3 3 3 3 3 2,40 40,00 31,45 22,45 8 468 0 2 3 3 3 3 3 3 3 2,30 35,15 29,77 24,51 18,48 9 473 0 2 3 3 3 3 3 3 3 2,30 40,00 33,31 20,87 17,93 10 475 0 1 3 3 3 3 3 3 3 2,20 40,00 32,39 26,45 21,49 3
Ngày sau công cƣờng độc
Điể m lâm sàng Tỷ lệ chết Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4
Gà thí nghiệm bắt đầu có biểu hiện triệu chứng ốm và chết từ ngày thứ 3. Gà bỏ ăn, ủ rũ, sã cánh, khó thở, vẩy mỏ, sau đó có 3 con gà chết, 4 con bắt đầu có biểu hiện bệnh nhẹ và 3 con có biểu hiện bệnh nặng. Gà ốm cũng có triệu chứng: vẩy mỏ, khó thở, chảy nƣớc mũi, chảy nƣớc mắt; sau đó mắt sƣng, phù mặt, mào tích tím tái ; sã cánh, xù lông; ỉa chảy phân xanh trắng, một số con xuất huyết da chân. Đến ngày thứ 4 thì 100% lô thí nghiệm chết.
Trong khi đó 5 gà đối chứng đƣợc nhỏ mũi bằng dung dịch PBS nuôi cách ly với gà đƣợc tiêm virus vẫn hoàn toàn khỏe mạnh, không hề có bất kỳ triệu chứng nào.
Từ bảng 4.3 có thể thấy sau thời gian ủ bệnh 36 giờ, gà đã bắt đầu ốm và chết. Gà chết với tốc độ nhanh, từ 48-96 giờ toàn bộ lô gà thí nghiệm đã chết.
Tỷ lệ chết của lô gà thí nghiệm đƣợc minh họa bằng biểu đồ dƣới đây
Hình 4.4. Biểu đồ tỷ lệ chết của gà công cƣờng độc virus H5N6 qua
đƣờng nhỏ mũi . .
2-Đánh giá mức độ bài thải virus của gà công cƣờng độc
Kết quả xét nghiệm virus bài thải cho thấy ngày đầu tiên sau công cƣờng độc đã có virus bài thải tuy nhiên chỉ phát hiện môt lƣợng rất nhỏ virus trong một vài gà ở lô thí nghiệm. Có thể đây là lƣợng virus còn mắc lại ở vùng hầu họng khi gà bị gây nhiễm ngày hôm trƣớc (Ct trung bình của cả lô là 38,61). Ngày thứ
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h Thời gian theo dõi
Giờ theo dõi sau công cƣờng độc Tỷ lệ
2 sau công cƣờng độc đã có 9/10 gà bài thải virus (chỉ số Ct trung bình khi xét nghiệm mẫu swab 10 gà thí nghiệm là 31,65). Ngày thứ 3và thứ 4 đã có 100% gà bài thải virus ra ngoài, và bài thải một lƣợng lớn với chỉ số Ct trung bình tƣơng ứng là 24,78 và 19,92.
Bảng 4.4. Chỉ số Ct trung bình của gà công cƣờng độc virus qua đƣờng nhỏ mũi qua đƣờng nhỏ mũi Thời gian theo dõi Ct trung bình gà sống sót Mức độ bài thải virus Ct trung bình gà chết Mức độ bài thải virus Ngày 1 38,61 - Ngày 2 31,65 + Ngày 3 22,65 +++ 20,92 +++ Ngày 4 19,92 ++++
Sau khi công cƣờng độc qua đƣờng nhỏ mũi, lƣợng virus đã nhân lên nhiều lần và gây bệnh cho gà với những triệu chứng ốm rõ rệt. Đặc biệt những gà chết có Ct trung bình cao hơn rất nhiều so với gà sống.
Nhƣ vậy virus A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) có độc lực cao đối với gà khi công cƣờng độc qua đƣờng nhỏ mũi khi nhỏ 106TCID50/100 ul/con, 100% gà chết sau 96 giờ. Gà sau công cƣờng độc có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích điển hình của của bệnh cúm gia cầm.
Một vài hình ảnh triệu chứng lâm sàng của gà công cƣờng độc virus H5N6 phân lập tại Nghệ An:
Hình 4.4. Gà có triệu chứng ỉa chảy Hình 4.6. Gà sã cánh, có triệu chứng thần kinh
4.2. BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ, VI THỂ CỦA ĐÀN GÀ SAU KHI CÔNG CƢỜNG ĐỘC CƢỜNG ĐỘC
4.2.1. Bệnh tích đại thể
Lấy mẫu với gà chết của 2 lô gà công cƣờng độc virus qua đƣờng tiêm tĩnh mạch và qua đƣờng nhỏ mũi, cùng với gà của lô đối chứng để mổ khám, so sánh bệnh tích đại thể và vi thể. Kiểm tra bệnh tích đại thể: mổ khám kiểm tra xoang mũi, miệng, cơ, các cơ quan nội tạng, não.
Gà lô đối chứng đƣợc tiêm và nhỏ PBS vẫn khỏe mạnh bình thƣờng, không có bệnh tích.
Gà 2 lô công cƣờng độc virus mổ khám thấy bệnh tích rất nặng, bệnh tích của gà thí nghiệm đƣợc thể hiện qua bảng 4.5.
Bảng 4.5. Bảng tổng hợp bệnh tích của lô gà thí nghiệm công cƣờng độc
STT Chỉ tiêu Số lƣợng Tỷ lệ
1 Mào, tích thâm tím, phù nề 11/20 55%
2 Da chân xuất huyết 7/20 35%
3 Xuất huyết dƣới da đầu, phù dƣới da đầu 11/20 55%
4 Não sung huyết, xuất huyết 12/20 60%
5 Xuất huyết dƣới da ngực 3/20 15%
6 Xuất huyết cơ đùi, cơ lƣờn 7/20 35%
7 Tuyến thymus xuất huyết 8/20 40%
10 Khí quản viêm, xuất huyết, chƣa nhiều dịch 20/20 100% 11 Phổi viêm, tụ huyết, xuất huyết 20/20 100%
13 Xuất huyết mỡ vành tim 14/20 70%
14 Gan sƣng, tụ huyết, xuất huyết 9/20 45%
15 Dạ dày tuyến xuất huyết 3/20 15%
16 Ruột xuất huyết 15/20 75%
17 Tuỵ xuất huyết, hoại tử 15/20 75%
18 Thận sƣng, tụ huyết, xuất huyết 11/20 55% 19 Túi Fabricius sƣng, phù, xuất huyết 12/10 60%
20 Lách sƣng, xuất huyết 7/20 35%
21 Xuất huyết mỡ phủ tạng 5/20 25%
5Bệnh tích xuất huyết đƣờng tiêu hóa cũng chiếm một tỷ lệ khá cao (75%), điều này phù hợp với các triệu chứng ỉa chảy đã quan sát đƣợc khi theo dõi lâm sàng. Bên cạnh đó các bệnh tích này còn cho biết đƣợc hệ hô hấp và hệ tiêu hóa là nơi mà virus tấn công và gây ra tác hại trầm trọng.
Qua quan sát triệu chứng lâm sàng ở đầu và mặt có hiện tƣợng phù, kết hợp với mổ khám thấy có hiện tƣợng phù keo nhày dƣới da với tỷ lệ 55% (quan sát hình ảnh 4.8) Bệnh tích này cũng là một trong những bệnh tích đặc trƣng của bệnh cúm gia cầm.
cơ đùi, cơ lƣờncó thể từ bệnh tích đại thể gà công cƣờng độccho không có sự khác biệt so với
Một vài hình ảnh bệnh tích khi mổ khám gà công cƣờng độc virus:
Não sung huyết, xuất huyết chiếm tỷ lệ khá cao tới 60%. Biến đổi này ở não gà bệnh có thể lý giải triệu chứng thần kinh nhƣ rối loạn vận động, sã cánh, hay ủ rũ ở gà bệnh.
Ngoài ra còn thấy bệnh tích nặng ở tim, xuất huyết mỡ vành tim chiếm một tỷ lệ cao, xuất huyết và phù dƣới da đầu, gan xuất huyết thành vệt, điểm. Bệnh tích xuất huyết tuyến tụy và xuất huyết da chân, xuất huyết mỡ phủ tạng cũng đƣợc phát hiện khi mổ khám gà công cƣờng độc, đây là những bệnh tích điển hình của bệnh cúm gia cầm.
Qua kết quả mổ khám, chúng ta thấy những tổn thƣơng đại thể quan sát đƣợc ở các cơ quan của gà bệnh đã lý giải đƣợc cơ bản các triệu chứng của gà
mắc Cúm gia cầm. Bên cạnh đó, chúng ta có thể thấy đƣợc sự tấn công của virus Cúm gia cầm H5N6 đã gây ra các biểu hiện có tính toàn thân và khi mắc bệnh Cúm thì biểu hiện bệnh lý thƣờng nặng nề dẫn đến tỷ lệ chết cao. Những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc cúm gia cầm H5N6 giống nhƣ những biến đổi bệnh lý của gà mắc cúm H5N1.
Từ bảng 4.8 chúng ta có thể thấy, bệnh tích của gà sau khi công cƣờng độc virus A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) xuất hiện ở khắp cơ quan trong cơ thể. Các tổn thƣơng bệnh lý rất đa dạng và biểu hiện ở hầu hết các cơ quan phủ tạng. Tuy nhiên có thể thấy các bệnh tích tập chung chủ yếu ở đƣờng hô hấp (100% gà đƣợc mổ khám có bệnh tích nặng ở khí quản và phổi, 85% gà mổ khám thấy xoang miệng, xoang mũi chứa nhiều dịch nhầy). Điều này giải thích cho các triệu chứng quan sát đƣợc khi theo dõi lâm sàng nhƣ: khó thở, chảy nƣớc mũi, vẩy mỏ.
Hình 4.7. Da chân xuất huyết Hình 4.8. Phù, xuất huyết dƣới da vùng đầu
Hình 4.11. Khí quản xuất huyết, chứa
dịch. Hình 4.12. Phổi phù, xuất huyết nặng
Hình 4.13. Thận sƣng, xuất huyết. Hình 4.14. Mỡ vành tim xuất huyết
Hình 4.17. Ruột xuất huyết Hình 4.18. Hậu môn xuất huyết.
Hình 4.19. Túi Fabricius sƣng, phù, xuất
huyết Hình 4.20. Tuyến Thymus xuất huyết
4.2.2. Bệnh tích vi thể
Kiểm tra bệnh tích vi thể: gồm có các cơ quan khí quản, phổi, lách, gan, thận, dạ dày tuyến, ruột, túi Fabricius, não. Xét nghiệm vi thể lô gà công cƣờng độc thấy bệnh tích vi thể lô gà công cƣờng độc có ở hầu hết các cơ quan, phủ tạng.
- Ở phổi: qua quan sát thấy có biểu hiện sung huyết, xuất huyết tràn lan (Hình 4.19 và 4.20). Hiện tƣợng sung huyết và xuất huyết ở phổi có thể quan sát rất rõ trên hình ảnh chụp đƣợc, các hồng cầu tập trung lấp đầy mạch quản và xuất huyết tràn ngập ở lòng các phế nang khi thành mạch bị tổn thƣơng, tế bào nội mạc sƣng phồng mức độ nặng. Bệnh tích này cũng phù hợp với bệnh tích đại thể khi mổ khám gà có thể thấy hiện tƣợng xuất huyết rất rõ. Qua đây cho thấy sự tổn thƣơng trầm trọng ở phổi của gà mắc Cúm H5N6 làm phổi suy giảm chức năng vốn có của nó.
-Khí quản: cấu trúc của khí quản bị phá hủy một cách trầm trọng, khí quản bị bào mòn, biểu mô bong tróc (Hình 4.25 và 4.26).
- Não: quan sát tiêu bản não thấy sung huyết: hồng cầu tập trung lấp đầy mạch quản não (Hình 4.27 và 4.28). Bên cạnh đó còn quan sát thấy xuất huyết ở não . Chính những tổn thƣơng trên đã gây ra sự chèn ép ở não làm cho gà bệnh có những triệu chứng thần kinh nhƣ rối loạn vận động.
-Virus công cƣờng độc tấn công mạnh, gây bệnh cấp tính trên gà nên diễn biến bệnh nhanh, gây ra hiện tƣợng sung huyết, xuất huyết tràn lan ở các cơ quan phủ tạng nhƣ gan, lách, thận ,dạ dày tuyến. Bệnh tích này có thể quan sát rất rõ trên các tiêu bản vi thể.
-Tuyến tụy: biến đổi vi thể quan sát rõ thấy sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, hoại tử (Hình 4.30). Các tế bào hồng cầu tập trung thành từng đám, nổi bật hơn cả là hình ảnh họai tử tế bào tuyến tụy một cách trầm trọng, ở vi trƣờng quan sát đƣợc hình ảnh nhiều đám tế bào bắt màu hồng đều một cách đồng nhất do hoại tử tế bào, nhân tế bào vỡ và tan vào nguyên sinh chất nên không có vết tích của nhân.
-Ruột là nơi virus Cúm tấn công gây bệnh sớm nên bao giờ ta cũng quan sát đƣợc biến đổi bệnh lý ở ruột. Đặc biệt với gà mắc bệnh mà có thể hiện triệu chứng lâm sàng thì quá trình biến đổi bệnh lý phức tạp hơn. Quan sát tiêu bản
vi thể (Hình 4.32) vùng niêm mạc quan sát thấy xuất huyết, các mạch quản bị sung huyết, cấu trúc lông nhung bị phá hủy.
-Túi fabricius: phù, xuất huyết là những bệnh tích chủ yếu của gà mắc cúm A/H5N6, dƣới sự tác động của virus làm cho các nang lympho bị thoái hóa, cấu trúc nang rời rạc; quan sát cấu trúc các nang lympho thấy có những nang cấu trúc đã bị phá hủy, lòng nang giãn rộng, các tế bào biểu mô của nang bị thoái hóa, bắt màu mờ nhạt hơn so với những nang cấu trúc còn nguyên vẹn.
Hình 4.23. Phổi xuất huyết tràn lan(HE,x100)
Hình 4.24. Phổi xuất huyết tràn lan(HE,x100)
Hình 4.25. Khí quản bị bào mòn, (HE,x100)
Hình 4.26. Biểu mô khí quản bong tróc (HE,x200)
Hình 4.27. Não xuất huyết Hình 4.28. Não sung huyết (HE,x100)
Hình 4.29. Thận xuất huyết (HE,x100) Hình 4.30. Tuyến tụy sung huyết, hoại tử (HE,x100)
Hình 4.31. Gan sung huyết, xuất huyết, có đám lympho xâm nhập (HE,x100)
Hình 4.32. Ruột xuất huyết, lông nhung ruột dung hợp(HE,x100)
Hình 4.33. Túi Fabricius xuất
huyết(HE,x100) Hình 4.34. Túi Fabticius bị phù(HE,x200)
Tóm lại bệnh tích vi thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cúm gia cầm H5N6 là: sung huyết, xuất huyết, phù, thoái hóa, hoại tử và thâm nhiễm tế bào viêm ở hầu hết các cơ quan phủ tạng của gà bệnh nhƣ phổi, gan, lách, thận, não, tim, ruột, tụy. túi fabricius, dạ dày tuyến, khí quản, tuyến ức trong đó hiện tƣợng sung huyết, xuất huyết chiếm tỷ lệ rất cao.
4.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC VACXIN VỚI VIRUS CÚM A/H5N6 CLADE 2.3.4.4B A/H5N6 CLADE 2.3.4.4B
Gà của từng lô đƣợc tiêm vacxin tƣơng ứng vào lúc 3 tuần tuổi. Vị trí tiêm: dƣới da cổ; liều lƣợng theo nhƣ hƣớng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể: 0,5 ml/liều/gà đối với vacxin Navet-vifluvac, 0,3 ml/liều/gà đối với vacxin Re-5 và Re-6. Ba tuần sau khi tiêm vacxin, gà đƣợc lấy máu và hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HI với các loại kháng nguyên tƣơng đồng với chủng vacxin.
4.3.1. Kết quả hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng nhóm vacxin Navet-vifluvac vifluvac
Vào thời điểm 3 tuần sau khi tiêm vacxin, lấy máu gà để kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng H5 bằng phƣơng pháp HI. Kết quả thể hiện trong bảng dƣới đây:
Bảng 4.6. Hiệu giá kháng thể trong nhóm gà tiêm vacxin Navet-vifluvac
Số mẫu XN
Hiệu giá kháng thể (log2)
0 ≤ 3 4 5 6 7 8 ≥ 9 GMT
Số mẫu đạt 29 6 3 2 5 4 4 3 2
4,7
Theo tiêu chuẩn ngành 10-TCN Bộ NN & PTNT năm 2005, hiệu giá