Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3. Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.8. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể
Phản ứng HI phát hiện kháng thể subtype H5 (hoặc các subtype khác) Huyết thanh kiểm tra: Huyết thanh gà không cần xử lý bằng RDE, a. Chuẩn bị kháng nguyên:
- Chuẩn độ kháng nguyên – Xác định hiệu giá HA (phản ứng ngƣng kết hồng cầu HA)
+ Pha kháng nguyên 4HAU/25 l: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngƣng kết hồng cầu chia cho 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của dịch niệu mô là 1/128 Đơn vị 4HAU = 128: 4 = 32
Nhƣ vậy sẽ trộn 1 phần dịch nƣớc trứng với 31 phần PBS để đạt đƣợc dung dịch kháng nguyên 4 HAU.
+ Chuẩn độ kháng nguyên 4 HAU
Sau khi pha, kháng nguyên 4 HAU phải đƣợc chuẩn độ lại. Tiến hành: Nhƣ phản ứng HA.
+ Đọc kết quả:
Pha không chuẩn: Kháng nguyên đặc: Nếu ngƣng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Nhƣ vậy, kháng nguyên 8 HAU phải đƣợc pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngƣng kết đến giếng thứ 2; Kháng nguyên loãng: Nếu ngƣng kết đến giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lƣợng kháng nguyên (bằng với lƣợng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngƣng kết đến giếng thứ 2.
b. Tiến hành phản ứng HI:
- Nhỏ 25 l PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng. - Nhỏ tiếp 25 l kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên.
- Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 l kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 l cuối cùng.
- Nhỏ 25 l kháng nguyên 4 HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25 l PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Nhỏ 25 l dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa, lắc đều. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả.
c. Đọc kết quả
Phản ứng (+) dƣơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy.
Hiệu giá HI của mẫu đƣợc tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện tƣợng ức chế ngƣng kết hồng cầu. Huyết thanh đƣợc coi là dƣơng tính khi có hiệu giá huyết thanh ≥ 1/16. Huyết thanh đối chứng âm tính phải có hiệu giá ≤ 1/4.
Chú ý: Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà nên có 1 giếng chỉ có huyết thanh và hồng cầu để kiểm tra hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu không đặc hiệu. Nếu phát hiện thấy có ngƣng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy ra với mẫu huyết thanh nào cần xử lý lại mẫu huyết thanh đó và kiểm tra lại bằng phản ứng HI.