Một số vacxin cúm gia cầm đƣợc ghi nhận hiện nay
- Vaccine truyền thống:
Virus cúm gia cầm đƣợc nuôi cấy trong phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, sau đó đƣợc vô hoạt bằng hóa chất β - propiolacton hoặc formaldehyt. Kháng nguyên virus sau khi vô hoạt đƣợc bổ sung chất bổ trợ nhũ dầu để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch. Sự tƣơng đồng giữa kháng nguyên trong vaccine và kháng nguyên của virus môi trƣờng có cùng subtype H (heamaglutinin tƣơng đồng) sẽ quyết định hiệu lực của vaccine.
Việc sử dụng các vaccine vô hoạt đã đạt đƣợc những hiệu quả về phƣơng diện sinh học và kinh tế ở một số nƣớc
- Vacxin vô hoạt đồng chủng:
Là vacxin đƣợc sản xuất chứa chủng virus gây bệnh cúm thực địa (auto genous) hay còn gọi là vacxin tự phát sinh, vacxin này đƣợc sử dụng tại Mexico, Pakistan và gần đây là ở Trung Quốc. Một trong những vacxin thuộc loại này đang đƣợc sử dụng hiện nay là vacxin của Aventis Pasteur, Nobilis, và Weike Harbin. Nhƣợc điểm cơ bản của vacxin này là không thể phân biệt đƣợc gia cầm tiêm vacxin và gia cầm nhiễm cúm thực địa khi kiểm tra kháng thể.
- Vacxin vô hoạt dị chủng
Ví dụ nhƣ vaccine vô hoạt H5N2 của Intervet (Hà Lan) và của Weiker (Trung Quốc).
Những vaccine này đƣợc sản xuất tƣơng tự nhƣ vaccine vô hoạt đồng chủng. Điểm khác biệt là các chủng virus sử dụng trong vaccine có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa, nhƣng có Neuraminidase (kháng nguyên N) dị chủng (OIE and Council of European Communities, 1992).
Đối với 2 loại vaccine đồng chủng và dị chủng khi so sánh sẽ thấy mức độ bảo hộ lâm sàng và việc giảm thải virus ra môi trƣờng bên ngoài của vaccine đồng chủng đƣợc cải thiện hơn do khối lƣợng kháng nguyên trong vaccine cao hơn. Đối với vaccine dị chủng, mức độ bảo hộ không tỷ lệ chặt chẽ với mức độ đồng chủng giữa gen ngƣng kết tố hồng cầu trong vaccine và chủng trên thực địa. Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh rằng vaccine vô hoạt đơn giá hoặc đa giá có chất hỗ trợ đã tạo ra kháng thể cho gia cầm, có tác dụng phòng vệ và làm giảm số nhiễm, số chết, không giảm đẻ trứng. Tuy vậy, gia cầm đƣợc tiêm vaccine này trở nên mắc bệnh mà không có triệu chứng lâm sàng nhƣng vẫn bài thải virus và vẫn tiềm tàng khả năng lây lan, gây bệnh nghiêm trọng (OIE and Council of European Communities, 1992; Klenk et al., 1983).
- Vacxin tái tổ hợp : Một vài loại vacxin tái tổ hợp virus cúm với virus đậu gà đã đƣợc sử dụng. Với Vacxin này, virus gây bệnh đậu đƣợc sử dụng nhƣ một vector để ghép gene mã hóa cho kháng nguyên H và N của virus cúm vì vậy sử dụng vacxin này cho phép phân biệt đƣợc gia cầm tiêm vacxin và gia cầm nhiễm cúm.
Vacxin này chủ yếu đƣợc sử dụng rộng rãi ở Mexico và bắt đầu đƣợc sử dụng ở Trung Quốc từ tháng 1 năm 2005 (Tô Long Thành, 2005).
Mặc dù biện pháp sử dụng vacxin tiêm phòng đã bƣớc đầu đƣợc ghi nhận nhƣ một công cụ khống chế bệnh cúm. Tuy nhiên chƣơng trình tiêm phòng vacxin chỉ thực sự hiệu quả khi đƣợc đồng thời thực hiện cùng hàng loạt các biện pháp khác: thực hiện an toàn sinh học triệt để, chƣơng trình kiểm tra huyết thanh học định kỳ (Trần Xuân Hạnh, 2004).
Vacxin vô hoạt virus cúm gia cầm tái tổ hợp (subtype H5N1, chủng Re-1) đã đƣợc Bộ Nông nghiệp Trung Quốc phê chuẩn là sản phẩm mới dùng cho gia cầm từ tháng 1 năm 2005. Vacxin rất có hiệu quả đối với bệnh cúm gia cầm, kích thích gia cầm sản xuất kháng thể với hiệu giá cao hơn và thời gian bảo hộ dài hơn. Các thực nghiệm đã chứng minh rằng thủy cầm đƣợc tiêm chủng vacxin này không bị nhiễm và không bài thải virus cúm gia cầm. Hiện nay, nhiều nƣớc trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật này để chế tạo chủng virus vacxin nhƣng chỉ có Trung Quốc là thành công và đã thƣơng mại hóa đƣợc vacxin.
Tuy nhiên, vacxin subtype H5N1 chủng Re-1 trên chỉ có tác dụng phòng bệnh đối với clade 1 và clade 2.3.2.1A. Việc ra đời thêm vacxin vô hoạt virus
cúm gia cầm tái tổ hợp subtype H5N1 chủng Re-5 đã giúp gia cầm phòng đƣợc thêm clade 2.3.4.
Đến năm 2012, vacxin cúm H5N1 chủng Re-1 và Re-5 đã không còn phù hợp với những chủng virus mới. Lúc này, Trung Quốc đã chế tạo thành công vacxin vô hoạt virus cúm gia cầm tái tổ hợp subtype H5N1 chủng Re-6 giúp phòng bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao với các clade 2.3.2.1A; 2.3.2.1B; 2.3.2.1C. Hiện nay, vacxin H5N1 chủng Re-6 này đƣợc sử dụng rộng rãi tại các tỉnh thành miền Bắc Việt Nam.
Theo quan điểm của OIE và FAO, thì vacxin nên đƣợc sử dụng thành một chiến lƣợc toàn diện phòng chống dịch cúm gia cầm, bao gồm 5 công đoạn là: An toàn sinh học, nâng cao nhận thức ngƣời dân, giám sát và chẩn đoán, loại bỏ gia cầm bệnh và sử dụng vacxin (Lê Văn Năm, 2007).
OIE đã khuyến cáo, đối với bệnh cúm gia cầm, việc sử dụng, tiêm chủng vacxin nhƣ một giải pháp, một công cụ hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế và tiến đến thanh toán bệnh cúm gia cầm ở vùng nhiễm bệnh (Council of European Communities, 1992).
- Yêu cầu cần đạt được đối với vaccine phòng bệnh cúm gia cầm
+ An toàn
Trong chế tạo vaccine, an toàn là chỉ tiêu quan trọng hàng đầu cần đƣợc quan tâm. An toàn vaccine là khi dùng cho vật chủ không gây bệnh và bệnh tích cho các cơ quan trong cơ thể gia cầm. Tuy nhiên những biểu hiện phản ứng cục bộ hoặc toàn thân nhẹ trong một thời gian ngắn (triệu chứng không đặc trƣng) có thể đƣợc chấp nhận ở một số loại vaccine nếu sau đó con vật trở lại khỏe mạnh và có miễn dịch. Tính an toàn của một vaccine còn phụ thuộc vào thời điểm đƣa vaccine vào cơ thể con vật.
+ Hiệu lực
Hiệu lực của vaccine phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó tính kháng nguyên của virus vaccine và tính đặc hiệu giữa kháng thể sinh ra và kháng nguyên là quan trọng nhất. Những virus có tính kháng nguyên cao và giữ đƣợc tính kháng nguyên cao sau khi đƣợc chế làm vaccine thì khả năng kích thích miễn dịch càng cao.
Tỷ lệ hiệu giá kháng thể đạt mức bảo hộ trong đàn ≥ 70% thì mới đƣợc coi là đàn đạt bảo hộ (Tô Long Thành, 2006)
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP- NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu độc lực của virus cúm gia cầm
A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) (clade 2.3.4.4B) phân lập tại
Việt Nam trên gà thí nghiệm bằng phƣơng pháp công cƣờng độc.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mức độ bài thải virus của gà thí nghiệm sau khi công cƣờng độc.
- Đánh giá hiệu giá kháng thể của các loại vacxin tiêm cho đàn gà thí nghiệm.
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng - Cục Thú Y. - Khu nuôi động vật của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng - Cục Thú Y.
3.3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nguyên liệu 3.3.1. Nguyên liệu
- Vacxin cúm gia cầm H5N1:
+ Vacxin Navet-vifluvac (clade 1) do Công ty NAVETCO sản xuất và cung cấp: Số lô 24, NSX 03/7/2015, HSD 02/7/2016.
+ Vacxin Re-5 (clade 2.3.4) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp: Số lô 2015007, NSX 09/10/2015, HSD 08/10/2016.
+ Vacxin Re-6 (clade 2.3.2.1) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp: Số lô 2016078, NSX 22/9/2015, HSD 21/9/2016.
- Lựa chọn virus sử dụng trong công cƣờng độc:
+ Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập tháng 7/2015 từ ổ dịch tại Nghệ An (A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)).
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: kháng nguyên chủng virus vacxin A/Anhui/1/2004 (clade 2.3.4) đƣợc dùng để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Re-5; kháng nguyên chủng virus vacxin A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1 A) đƣợc dùng để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Re-6. Kháng nguyên A/ck/VN1203/2004 (clade 1) đƣợc dùng
để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Navet-vifluvac. Đây là các kháng nguyên gần với các chủng virus vacxin tƣơng ứng do Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ƣơng cung cấp.
- Gà thí nghiệm: Gà đƣợc chọn từ đàn gà khỏe mạnh, không có virus cúm type A (kiểm tra mẫu swab bằng phƣơng pháp Real time RT-PCR), chƣa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm và không có kháng thể cúm H5 (kiểm tra mẫu huyết thanh bằng phƣơng pháp HI).
- Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đoán, xét nghiệm cúm gia cầm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng nhƣ:
+ Môi trƣờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) + Môi trƣờng Glycerol
+ Dung dịch PBS 0,01M pH7.2
+ Dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85%: + Dung dịch hồng cầu gà 0,5%:
+ RNA đối chứng dƣơng tính M, H5 và H7 (đƣợc NVSL cung cấp) + Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296-010 hoặc 10296-028) +Mercaptethanol
+ Kít chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep)
+ Kit RT-PCR 1 bƣớc Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript
RT-PCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928- 034 hoặc 10928-042, Invitrogen).
+ Mẫu dò và primer
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Thí nghiệm đánh giá độc lực của virus trên gà bằng phương pháp công cường độc qua đường tiêm tĩnh mạch
- Sử dụng 15 con gà 3-4 tuần tuổi,âm tính với virus cúm và huyết thanh âm tính với kháng thể cúm .
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua tiêm tĩnh mạch
Nhóm gà Số con Liều tiêm Ghi chú
Đối chứng G1 5 100µl PBS/con Nuôi cách ly 2 lô thí nghiệm
Thí nghiệm G2 10 106 TCID50 (100µl/con)
-Theo dõi gà thí nghiệm 10 ngày, chấm điểm lâm sàng 2 lô gà thí nghiệm, ghi chép lại các triệu chứng , bệnh tích, tỷ lệ chết.
- Lấy mẫu swab hầu họng và swab hậu môn vào các thời điểm 1, 2, 3 …10 ngày sau công cƣờng độc hoặc cho đến khi gà chết.
- Xét nghiệm virus bài thải bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. - Gà sống sót sau công cƣờng độc tiến hành lấy máu và kiểm tra HI. - Tính thời gian chết trung bình Mean Death Time.
3.3.2.2. Thí nghiệm đánh giá độc lực của virus trên gà bằng phương pháp công cường độc qua đường nhỏ mũi
- Sử dụng 15 con gà 3-4 tuần tuổi, âm tính với virus cúm và huyết thanh âm tính với kháng thể cúm.
- Bố trí thí nghiệm theo bảng sau:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua đƣờng nhỏ mũi
Nhóm gà Số con Liều nhỏ mũi Ghi chú
Đối chứng G1 5 100µl PBS/con
Nuôi cách ly 2 lô thí nghiệm Thí nghiệm G2 10 106 TCID50 (100µl/con)
-Theo dõi gà thí nghiệm 10 ngày, ghi chép lại các triệu chứng , bệnh tích, tỷ lệ chết.
- Lấy mẫu swab hầu họng và swab hậu môn vào các thời điểm 1, 2….10 ngày sau công cƣờng độc hoặc cho đến khi gà chết.
- Xét nghiệm virus bài thải bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. - Gà sống sót sau công cƣờng độc tiến hành lấy máu và kiểm tra HI.
3.3.2.3. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực vacxin
Sử dụng 100 gà 3 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với virus cúm gia cầm, đƣợc chia thành 4 lô: 3 lô đƣợc tiêm vacxin và 1 lô đối chứng không đƣợc tiêm vacxin. Bố trí thí nghiệm cụ thể theo bảng nhƣ sau:
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin Nhóm gà Số lƣợng Liều tiêm vacxin Ghi chú
Navet-vifluvac 30 0,5 ml 0,3 ml 0,3 ml Nuôi cách ly các lô gà thì nghiệm Re-5 30 Re-6 30
Đối chứng 10 Không tiêm vacxin
- Gà của từng lô đƣợc tiêm vacxin tƣơng ứng vào lúc 3 tuần tuổi. Vị trí tiêm: dƣới da cổ; liều lƣợng theo nhƣ hƣớng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể: 0,5 ml/liều/gà đối với vacxin Navet-vifluvac , 0,3 ml/liều/gà đối với vacxin Re-5 và Re-6.
- Ba tuần sau khi tiêm vacxin, gà đƣợc lấy máu và hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HI với các loại kháng nguyên tƣơng đồng với chủng vacxin.
- Mỗi lô vacxin chon 10 gà làm thí nghiệm công cƣờng độc, gà không đƣợc chọn ngẫu nhiên mà đƣợc chọn theo tỷ lệ phân bố các mức kháng thể, sao cho số gà đƣợc chọn là đại diện cho cả nhóm gà tiêm vacxin.
- Tiến hành công cƣờng độc lúc 6 tuần tuổi. Lƣợng virus dùng để công cƣờng độc: 106TCID50/100≤µl/con. Đƣờng gây nhiễm là nhỏ mũi đối với các nhóm vacxin và đối chứng.
- Quan sát gà thí nghiệm, theo dõi lâm sàng trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, lấy mẫu swabs họng vào ngày thứ 3 và thứ 10 hoặc khi gà chết để định lƣợng virus bài thải bằng phƣơng pháp rRT-PCR. Đối với gà chết, mổ khám để đánh giá bệnh tích đại thể, lấy mẫu làm tiêu bản vi thể.
3.3.3. Phƣơng pháp điều tra hồi cứu
gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm, kết quả tiêm phòng vacxin, kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng từ năm 2014 đến nay. Từ đó đánh giá đƣợc hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa.
3.3.4. Phƣơng pháp mổ khám toàn diện
Đối với những gà mắc Cúm còn sống, quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích bên ngoài, trên da. Với những gia cầm gần chết hoặc đã chết có triệu chứng rõ ràng, tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích vi thể của tất cả các cơ quan theo Quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
- Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết, ...).
- Ngƣời tham gia mổ khám phải mang đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ đã đƣợc chuẩn bị trƣớc.
- Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thƣơng...
- Mổ khám kiểm tra bên trong.
- Nhúng ƣớt lông gia cầm bằng nƣớc có pha dung dịch sát trùng.
- Đặt gia cầm nằm ngửa trên bàn mổ, dùng kéo hoặc dao cắt da giữa vùng bụng và bẹn ở hai bên chân, lật chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi.
- Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xƣơng lƣỡi hái, một tay cầm hai chân tay kia cầm phần da trên xƣơng hái kéo ngƣợc chiều nhau lên tận vùng diều bộc lộ cơ ngực.
- Kiểm tra cơ ngực, cơ đùi, xƣơng lƣỡi hái về tình trạng khô cơ, xuất huyết, biến dạng...
- Dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dƣới mỏ bộc lộ diều, thực quản, khí quản, tuyến Thymus để kiểm tra bên ngoài.
- Dùng kéo cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xƣơng lƣỡi hái , cắt tiếp lên phía trên hai bên sụn sƣờn qua xƣơng đòn, xƣơng quạ, loại những tổ chức dính, nhấc bỏ xƣơng lƣỡi hái ra ngoài bộc lộ xoang bụng và xoang ngực.
- Quan sát các túi khí và phía ngoài các cơ quan nội tạng trong xoang bụng và xoang ngực.
- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm. - Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra màu sắc, kích thƣớc, hoại tử.... - Kiểm tra tuyến tụy.
- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau để kiểm tra sau cùng tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.
- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịch hoàn, ống dẫn tinh).
- Kiểm tra thận, ống dẫn niệu .
- Kiểm tra túi Fabricius bên ngoài và bên trong về hình dáng, kích thƣớc, màu sắc, dịch.
- Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng. Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang.
- Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong.