Nhóm Gà Chỉ số Ct trung bình Ngày 3 Mức độ bài thải virus Ngày 10 Mức độ bài thải virus Ngày chết Mức độ bài thải virus Navet-vifluvac 34,83 + 36,62 - 19,81 ++++ Re-5 27,40 ++ 33,21 + 25,75 ++ Re-6 28,17 ++ 34,77 + 22,56 +++ Đối chứng 31,47 + 19,53 ++++
- Nhóm gà đối chứng không đƣợc tiêm vacxin có tỷ lệ chết 100% trong 2- 5 ngày và mức độ bài thải virus là rất cao (với Ct trung bình =19,53).
- Nhóm vacxin Navet-vifluvac :
Sau khi gây nhiễm virus công cƣờng độc 3 ngày nhóm gà tiêm vacxin Navet-vifluvac đã bài thải một lƣợng nhỏ virus với Ct trung bình = 34,83.
Những gà chết trong nhóm vacxin này đều phát hiện đƣợc một lƣợng virus bài thải qua mẫu swab hầu họng rất cao (chỉ số Ct trung bình = 19,81).
Sau 10 ngày công cƣờng độc mức độ bài thải virus ra ngoài môi trƣờng đã giảm đi (Ct trung bình = 36,62). Nhƣ vậy vacxin Navet-vifluvac đã có tác dụng làm giảm lƣợng virus bài thải ra ngoài trong trƣờng hợp gà bị nhiễm virus H5N6 clade 2.3.4.4B.
-Nhóm vacvin Re-5:
Sau khi công cƣờng độc, nhóm gà vacxin Re-5 đã bài thải một lƣợng lớn vaxcin ra ngoài với Ct trung bình = 27,40 ở ngày thứ 3.
Sau 10 ngày công cƣờng độc vacxin Re-5 đã có tác dụng làm giảm lƣợng virus ra ngoài môi trƣờng, tuy nhiên lƣợng virus bài thải này vẫn khá nhiều (xét nghiệm mẫu swab cho chỉ số Ct trung bình = 33,21).
Những gà chết bài thải một lƣợng lớn virus ra ngoài môi trƣờng (Ct trung bình = 25,75).
-Nhóm vacxin Re-6
Sau khi công cƣờng độc 3 ngày, nhóm gà vacxin Re-6 đã bài thải một lƣợng khá nhiều virus ra ngoài, chỉ số Ct khi xét nghiệm mẫu swab hầu họng trung bình là 28,17.
Sau 10 ngày công cƣờng độc virus A/H5N6 clade 2.3.4.4B , vacxin Re-6 đã có tác dụng làm giảm sự bài thải virus ra ngoài môi trƣờng so với ngày thứ 3 sau công, tuy nhiên lƣợng virus bài thải tại thời điểm ngày thứ 10 là tƣơng đối thấp (Ct trung bình khoảng 34,77).
Những gà chết xét nghiệm mẫu swab hầu họng cho thấy một lƣợng rất lớn virus (Ct trung bình khoảng 22,56).
Kết quả chỉ số Ct trung bình tại các thời điểm lấy mẫu đƣợc minh họa trên biểu đồ sau:
34.83 27.4 28.17 31.47 36.62 33.21 34.77 19.81 25.75 22.56 19.53 15 20 25 30 35 40
Navet-vifluvac Re-5 Re-6 Đối chứng
Hình 4.87. Biểu đồ so sánh mức độ bài thải virus của các nhóm gà sau công cƣờng độc
Nhƣ vậy có thể thấy gà chết bài thải một lƣợng virus rất lớn ra ngoài môi trƣờng . Vẫn phát hiện virus bài thải 10 ngày sau công cƣờng độc đối với gà của cả 3 nhóm vacxin tuy nhiên lƣợng virus đều giảm đáng kể. Nhóm gà tiêm vacxin Re-5 và Re-6 vẫn còn bài thải một lƣợng nhỏ virus sau ngày công thứ 10..
Giá trị Ct
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1. KẾT LUẬN
- Virus cúm gia cầm A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)
là virus có độc lực cao, chỉ số IVPI = 2,84 và gây chết 100% gà thí nghiệm trong 52 giờ.
- Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể của gà công cƣờng độc virus H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập tại Nghệ An không có sự khác biệt so với bệnh tích của gà mắc H5N1.
- Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của gà đƣợc tiêm vacxin Navet- vifluvac là 4,7; của gà đƣợc tiêm vacxin Re-6 là 5,3 và của gà đƣợc tiêm vacxin Re-5 là 7,8.
-Khi đƣợc công cƣờng độc với virus cúm gia cầm
A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6) (clade 2.3.4.4B), tỷ lệ bảo
hộ của các lô gà đƣợc tiêm vacxin Navet-vifluvac, vacxin Re-6 hoặc vacxin Re-5 đều đạt 70%.
- Gà của cả 3 lô thí nghiệm vẫn bài thải virus tới ngày thứ 10 sau khi công cƣờng độc virus H5N6 phân lập tại Nghệ An, tuy nhiên lƣợng virus bài thải thấp hơn nhiều so với gà đối chứng.
- Có thể sử dụng vacxin Re-5 , Re -6 và Navet-vifluvac để phòng bệnh cúm gia cầm do virus Laos- like A/H5N6 clade 2.3.4.4B gây ra.
5.2. ĐỀ NGHỊ
- Cần đánh giá độc lực đối với những chủng virus mới phân lập đƣợc. - Thƣờng xuyên đánh giá hiệu lực các loại vacxin hiện hành với các chủng virus cúm đang lƣu hành hoặc mới xuất hiện.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Ban Chỉ đạo quốc gia phòng chống cúm gia cầm (2005). Kế hoạch hành động khẩn cấp khi xảy ra dịch cúm gia cầm (H5N1) và đại dịch cúm ở ngƣời, Hà Nội. 2. Ban Chỉ đạo quốc gia phòng chống Cúm gia cầm (2005). Báo cáo tổng kết công tác 2 năm (2004-2005) phòng chống dịch Cúm gia cầm. Hội nghị tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gia gà, ngày 18 tháng 4 năm 2005, Hà Nội.
3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005). Kế hoạch dự phòng chống dịch cúm gia cầm chủng độc lực cao tại Việt Nam, Hà Nội
4. Bùi Quang Anh (2004). Bệnh cúm gia cầm: Lƣu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XI số 3-2004, tr.69.
5. Cục Thú y (2014). Báo cáo tóm tắt kết quả công tác thú y 2014 và kế hoạch công tác năm 2015.
6. Cục Thú y (2015). Báo cáo tóm tắt kết quả công tác thú y 2015 và kế hoạch công tác năm 2016.
7. Lê Văn Năm (2004). Bệnh cúm gà. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y, Tập XI số 1, tr. 81-86.
8. Lê Văn Năm (2007). Đại dịch cúm gia cầm và nguyên tắc phòng chống. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XIV số 2-2007, tr.91-94.
9. Nguyễn Nhƣ Thanh và Lê Thanh Hoà (1997). Miễn dịch học thú y. NXB Nông nghiệp,Hà Nội.
10. Nguyễn Tiến Dũng (2008). Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV số 4-2008, tr.80-86.
11. Nguyễn Tiến Dũng (2008). Sự đa dạng của các dòng virus cúm A(H5N1) tại Việt Nam từ 2005-2007. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV số 4-2008, tr.9-15.
12. Suarez và Mary Pantin-Jackwood (2008). Tiêm vacxin để khống chế bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao, Hội thảo quốc tế Nghiên cứu phục vụ hoạch định chích sách phòng chống cúm gia cầm, 16-18/6/2008, Hà Nội.
13. Tô Long Thành (2005). Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XII số 1- 2005, tr.84-91.
14. Tô Long Thành (2005).Kinh nghiệm phòng chống dịch cúm gia cầm và sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung Quốc. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XII số 3 – 2005, Tr.87-90.
15. Tống Xuân Độ (2009).Giám sát sự lƣu hành Vi rút cúmA/H5N1 và đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine cúm gia cầm tại địa bàn tỉnh Quảng Ninh. Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp. Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr.69
16. Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, (2004). Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng chống. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
17. Trần Xuân Hạnh (2004). Một vài vấn đề trong phòng chống bệnh Cúm gia cầm bằng vaccine. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XI số 3, tr.77-84.
18. Vũ Thị Mỹ Hạnh và Tô Long Thành (2008). Kiểm nghiệm vacxin cúm gia cầm H5N1 của Trung Quốc sƣ dụng trong giai đoạn 2006-2007. Khoa học kỹ thuật thú y. Tập XV số 4-2008, tr. 25-32.
19. Vũ Triệu An (1998). Miễn dịch học. NXB Y học Hà Nội, tr. 42 – 64.
Tài liệu internet:
20. Nguyễn Hải Khánh (2010). Viện sốt rét-Ký sinh trùng. (http://www.impe- qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoPreview.jsp?ID=4239) ( Truy cập trang web ngày 21/10/2016)
21. Nguyễn Đình Nguyên (2008). Hiệu quả điều trị cúm A và cúm gia cầm A/H5N1 của thuốc kháng virus thuộc nhóm ức chế neurominidae: Tamiflu và Relenza. (http://vietsciences.free.fr/) ( Truy cập trang web ngày 21/10/2016)
Tiếng Anh:
22. Beard. C. W, M. Brugh and R.G.Webter (1987). Emegence of amantadine - resistant H5N1 avian influenza virus during a simulate layer flock treatment program. Avian dis, 31, pp.533-537.
23. Biswas. S.K and D.P. Nayak, (1996). Influenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites. J.Virol, 70, pp.6716-6722.
24. Bosch. F.X, M. Orlich, H.D.klenk and R.Rott (1979). The structure of the hemagglutinin, a deteminant for the pathogenicity of influenza viruses. Virology (95), pp.197-207.
25. Buckler White and B. R. Muphy (1998). Nucleotide sequence analysis of the nucleoprotein gene of an avian and a human influenza virus strain
identifies two classes of nucleoproteins. Virology 155: 345 - 355.
26. Castrucci. M. R and Y.Kawaoka (1993). Biologic importance of neuramidase stlak length influenza A virus. J.Viriol (67), pp.759-764
27. Holsinger. L. D, D. Nichani, L. H. Pinto and R. A. Lamb (1994). Influenza A virus M2 ion chanel protein: a structurefunction anylasis. J. Viriol 68, pp.1551-1563. 28. Horimoto. T and Kawaoka Y (2001). Pandemic threat posed by avian influenza
viruses. Clind Microbiol Rev, 14(1), pp.129-149
29. Ian Tizard (1982). An introduction to veterinary immunology. Second edition, W. B. Saunders company
30. Ito, T and Y. Kawaoka (1998). Avian influenz, p. 126-136. In K. G. Nicholson, R. G. Webster, and A. J. Hay (ed). Textbook of influenza. Blackwell sciences Ltd, Oxford, United Kingdom.
31. Kawaoka. Y (1991). Difference in receptor specificity among influenza A viruses from different species of animal. J. Vet. Med. Sci 53, pp.357-358. 32. Lu. X, T. M. Tumpey and J. M. Katz (1999). A mouse model for the evalution
of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolate from human. J.Viriol, 73, pp.5903-5911.
33. Luong. G and Palese. P (1992). Genetic anylaysis of influenza virus. Curr Opinion Gen Develop 2, pp.77-81.
34. Muphy. B.R and R.G Webter (1996). Orthomyxoviruses. Lippincott-Raven Pblishers, Philadenphia, Pa.
35. OIE, Council of European Communities (1992). Council Directive 92/40/Eec of 19 th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza, “Official Journal of European Communities”, L167, 1 - 15.
36. Seo.S and R.G. webter (2001). Cross-relative cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in the HongKong poultry markets. J. Viriol, 75, pp.2516-2525.
37. Suares. D. L, M. L. Perdue and D. E. Swayne (1998). Comparisons of hightly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong. J. Viriol 72, pp.6678-6688
38. Very. M, M. Orlich, S. Adle, H. D. Klenk, R. Rott and W. Garten (1992). Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R. Virology 188, pp.408-413.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: thành phần và cách pha nguyên liệu dùng trong chẩn đoán cúm
- Môi trƣờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) + Bổ sung kháng sinh Penicillin G 2.000.000U/lít Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U/lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U/lít Ofloxacin HCl 60 mg/lít Sulfmethoxasole 200 mg/lít - Môi trƣờng Glycerol + Pha chế PBS NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nƣớc cất vđ 1000 ml
+ Hấp vô trùng (1210C/15 phút), bổ sung kháng sinh (nhƣ trên) và trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1
Phụ lục 2: Lƣợng chất phản ứng Real time RT - PCR dùng cho các cặp mồi phát hiện gen MA (Cúm A), H5.
Thành phần Liều lƣợng cho 1 phản ứng Hàm lƣợng cuối cùng
H2O 6,95 l
5X buffer 5 1X
25mM MgCl2 1,25 3,75 mM*
dNTP's (10mM mỗi loại) 0,8 320 M mỗi loại dNTP Mồi chạy xuôi (20 pmol/ml) 0,5 10 pmol/25 l
Mồi chạy ngƣợc (20 pmol/ml) 0,5 10 pmol/25 l Rnase Inhibitor (13,3 units/ml) 0,5 0,266 units/l
Enzyme Mix 1,0
Mẫu dò (6 pmol/ml) 0,5 0,12 M
Tổng lƣợng cho 1 phản ứng 17 l
Mẫu ARN 8 l
Lƣợng toàn bộ trong ống mẫu 25 l
Phụ lục 3: Bảng chu kỳ nhiệt của bƣớc phiên mã ngƣợc (RT) dùng cho Quiagen one step RT-PCR kit.
Bƣớc phiên mã ngƣợc 1 chu kỳ 30 phút 500C
15 phút 950C
Phụ lục 4: Bảng chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi.
Cặp mồi Bƣớc Thời gian Nhiệt độ
AIV matrix (M) 45 chu kỳ Biến tính 1 giây 94 0
C Bám của cặp mồi 20 giây 600C
H5 40 chu kỳ
Biến tính 1 giây 940C
Bám của cặp mồi 20 giây 570C Kéo dài chuỗi tổng hợp 5 giây 720C
Chú ý: Màu huỳnh quang đƣợc xác định ở bƣớc bám gắn của cặp mồi. Phụ lục 5: Bảng kết quả theo dõi lâm sàng và kết quả Ct các lô gà thí nghiệm.
Phụ lục 4: Một vài hình ảnh trong quá trình thí nghiệm
Công cƣờng độc virus Cúm gia cầm Gà thí nghiệm nuôi cách ly