3.3.1. Nguyên liệu
- Vacxin cúm gia cầm H5N1:
+ Vacxin Navet-vifluvac (clade 1) do Công ty NAVETCO sản xuất và cung cấp: Số lô 24, NSX 03/7/2015, HSD 02/7/2016.
+ Vacxin Re-5 (clade 2.3.4) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp: Số lô 2015007, NSX 09/10/2015, HSD 08/10/2016.
+ Vacxin Re-6 (clade 2.3.2.1) do Trung Quốc sản xuất, Công ty RTD cung cấp: Số lô 2016078, NSX 22/9/2015, HSD 21/9/2016.
- Lựa chọn virus sử dụng trong công cƣờng độc:
+ Virus cúm gia cầm H5N6 clade 2.3.4.4B phân lập tháng 7/2015 từ ổ dịch tại Nghệ An (A/Mdk/Vietnam(NgheAn)/NCVD15A52/2015(H5N6)).
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 dùng cho phản ứng HI: kháng nguyên chủng virus vacxin A/Anhui/1/2004 (clade 2.3.4) đƣợc dùng để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Re-5; kháng nguyên chủng virus vacxin A/Hubei/1/2010 (clade 2.3.2.1 A) đƣợc dùng để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Re-6. Kháng nguyên A/ck/VN1203/2004 (clade 1) đƣợc dùng
để kiểm tra mẫu huyết thanh gà đƣợc tiêm vacxin Navet-vifluvac. Đây là các kháng nguyên gần với các chủng virus vacxin tƣơng ứng do Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ƣơng cung cấp.
- Gà thí nghiệm: Gà đƣợc chọn từ đàn gà khỏe mạnh, không có virus cúm type A (kiểm tra mẫu swab bằng phƣơng pháp Real time RT-PCR), chƣa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm và không có kháng thể cúm H5 (kiểm tra mẫu huyết thanh bằng phƣơng pháp HI).
- Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đoán, xét nghiệm cúm gia cầm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng nhƣ:
+ Môi trƣờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) + Môi trƣờng Glycerol
+ Dung dịch PBS 0,01M pH7.2
+ Dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85%: + Dung dịch hồng cầu gà 0,5%:
+ RNA đối chứng dƣơng tính M, H5 và H7 (đƣợc NVSL cung cấp) + Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296-010 hoặc 10296-028) +Mercaptethanol
+ Kít chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep)
+ Kit RT-PCR 1 bƣớc Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript
RT-PCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928- 034 hoặc 10928-042, Invitrogen).
+ Mẫu dò và primer
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.3.2.1. Thí nghiệm đánh giá độc lực của virus trên gà bằng phương pháp công cường độc qua đường tiêm tĩnh mạch
- Sử dụng 15 con gà 3-4 tuần tuổi,âm tính với virus cúm và huyết thanh âm tính với kháng thể cúm .
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua tiêm tĩnh mạch
Nhóm gà Số con Liều tiêm Ghi chú
Đối chứng G1 5 100µl PBS/con Nuôi cách ly 2 lô thí nghiệm
Thí nghiệm G2 10 106 TCID50 (100µl/con)
-Theo dõi gà thí nghiệm 10 ngày, chấm điểm lâm sàng 2 lô gà thí nghiệm, ghi chép lại các triệu chứng , bệnh tích, tỷ lệ chết.
- Lấy mẫu swab hầu họng và swab hậu môn vào các thời điểm 1, 2, 3 …10 ngày sau công cƣờng độc hoặc cho đến khi gà chết.
- Xét nghiệm virus bài thải bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. - Gà sống sót sau công cƣờng độc tiến hành lấy máu và kiểm tra HI. - Tính thời gian chết trung bình Mean Death Time.
3.3.2.2. Thí nghiệm đánh giá độc lực của virus trên gà bằng phương pháp công cường độc qua đường nhỏ mũi
- Sử dụng 15 con gà 3-4 tuần tuổi, âm tính với virus cúm và huyết thanh âm tính với kháng thể cúm.
- Bố trí thí nghiệm theo bảng sau:
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm kiểm tra độc lực virus qua đƣờng nhỏ mũi
Nhóm gà Số con Liều nhỏ mũi Ghi chú
Đối chứng G1 5 100µl PBS/con
Nuôi cách ly 2 lô thí nghiệm Thí nghiệm G2 10 106 TCID50 (100µl/con)
-Theo dõi gà thí nghiệm 10 ngày, ghi chép lại các triệu chứng , bệnh tích, tỷ lệ chết.
- Lấy mẫu swab hầu họng và swab hậu môn vào các thời điểm 1, 2….10 ngày sau công cƣờng độc hoặc cho đến khi gà chết.
- Xét nghiệm virus bài thải bằng phƣơng pháp realtime RT-PCR. - Gà sống sót sau công cƣờng độc tiến hành lấy máu và kiểm tra HI.
3.3.2.3. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực vacxin
Sử dụng 100 gà 3 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với virus cúm gia cầm, đƣợc chia thành 4 lô: 3 lô đƣợc tiêm vacxin và 1 lô đối chứng không đƣợc tiêm vacxin. Bố trí thí nghiệm cụ thể theo bảng nhƣ sau:
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin Nhóm gà Số lƣợng Liều tiêm vacxin Ghi chú
Navet-vifluvac 30 0,5 ml 0,3 ml 0,3 ml Nuôi cách ly các lô gà thì nghiệm Re-5 30 Re-6 30
Đối chứng 10 Không tiêm vacxin
- Gà của từng lô đƣợc tiêm vacxin tƣơng ứng vào lúc 3 tuần tuổi. Vị trí tiêm: dƣới da cổ; liều lƣợng theo nhƣ hƣớng dẫn của nhà sản xuất, cụ thể: 0,5 ml/liều/gà đối với vacxin Navet-vifluvac , 0,3 ml/liều/gà đối với vacxin Re-5 và Re-6.
- Ba tuần sau khi tiêm vacxin, gà đƣợc lấy máu và hiệu giá kháng thể kháng cúm H5 đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp HI với các loại kháng nguyên tƣơng đồng với chủng vacxin.
- Mỗi lô vacxin chon 10 gà làm thí nghiệm công cƣờng độc, gà không đƣợc chọn ngẫu nhiên mà đƣợc chọn theo tỷ lệ phân bố các mức kháng thể, sao cho số gà đƣợc chọn là đại diện cho cả nhóm gà tiêm vacxin.
- Tiến hành công cƣờng độc lúc 6 tuần tuổi. Lƣợng virus dùng để công cƣờng độc: 106TCID50/100≤µl/con. Đƣờng gây nhiễm là nhỏ mũi đối với các nhóm vacxin và đối chứng.
- Quan sát gà thí nghiệm, theo dõi lâm sàng trong vòng 10 ngày sau khi gây nhiễm, lấy mẫu swabs họng vào ngày thứ 3 và thứ 10 hoặc khi gà chết để định lƣợng virus bài thải bằng phƣơng pháp rRT-PCR. Đối với gà chết, mổ khám để đánh giá bệnh tích đại thể, lấy mẫu làm tiêu bản vi thể.
3.3.3. Phƣơng pháp điều tra hồi cứu
gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm, kết quả tiêm phòng vacxin, kết quả xét nghiệm giám sát huyết thanh sau tiêm phòng từ năm 2014 đến nay. Từ đó đánh giá đƣợc hiệu quả của việc tiêm phòng vacxin cúm trên thực địa.
3.3.4. Phƣơng pháp mổ khám toàn diện
Đối với những gà mắc Cúm còn sống, quan sát triệu chứng lâm sàng và kiểm tra bệnh tích bên ngoài, trên da. Với những gia cầm gần chết hoặc đã chết có triệu chứng rõ ràng, tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích vi thể của tất cả các cơ quan theo Quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.
- Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết, ...).
- Ngƣời tham gia mổ khám phải mang đầy đủ các trang thiết bị bảo hộ đã đƣợc chuẩn bị trƣớc.
- Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thƣơng...
- Mổ khám kiểm tra bên trong.
- Nhúng ƣớt lông gia cầm bằng nƣớc có pha dung dịch sát trùng.
- Đặt gia cầm nằm ngửa trên bàn mổ, dùng kéo hoặc dao cắt da giữa vùng bụng và bẹn ở hai bên chân, lật chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi.
- Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xƣơng lƣỡi hái, một tay cầm hai chân tay kia cầm phần da trên xƣơng hái kéo ngƣợc chiều nhau lên tận vùng diều bộc lộ cơ ngực.
- Kiểm tra cơ ngực, cơ đùi, xƣơng lƣỡi hái về tình trạng khô cơ, xuất huyết, biến dạng...
- Dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dƣới mỏ bộc lộ diều, thực quản, khí quản, tuyến Thymus để kiểm tra bên ngoài.
- Dùng kéo cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xƣơng lƣỡi hái , cắt tiếp lên phía trên hai bên sụn sƣờn qua xƣơng đòn, xƣơng quạ, loại những tổ chức dính, nhấc bỏ xƣơng lƣỡi hái ra ngoài bộc lộ xoang bụng và xoang ngực.
- Quan sát các túi khí và phía ngoài các cơ quan nội tạng trong xoang bụng và xoang ngực.
- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm. - Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra màu sắc, kích thƣớc, hoại tử.... - Kiểm tra tuyến tụy.
- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau để kiểm tra sau cùng tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác.
- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịch hoàn, ống dẫn tinh).
- Kiểm tra thận, ống dẫn niệu .
- Kiểm tra túi Fabricius bên ngoài và bên trong về hình dáng, kích thƣớc, màu sắc, dịch.
- Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng. Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang.
- Dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong. - Dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong.
- Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, các xoang và van ...
- Tách phổi khỏi các xƣơng sƣờn kiểm tra về màu sắc, độ xốp.
- Bộc lộ dây thần kinh cánh ở trƣớc xƣơng sƣờn thứ nhất, dây thần kinh hông ở trong cơ đùi hoặc trong xoang chậu dƣới thận để kiểm tra sƣng.
- Rạch khớp gối kiểm tra dịch, bẻ xƣơng đùi kiểm tra độ cứng mềm, chẻ dọc xƣơng đùi kiểm tra tuỷ.
- Cắt đầu gia cầm ở đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xƣơng cắt sang hai bên từ lỗ chẩm đến cạnh trƣớc xƣơng đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não. Dùng kéo cong vô trùng tách màng não, cắt các dây thần kinh lấy não.
- Dùng kéo rạch ruột rạch từ dạ dày tuyến xuống tận hậu môn, kiểm tra các tổn thƣơng, hoại tử, xuất huyết, ký sinh trùng ...
- Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm trong phòng thí nghiệm.
- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. - Xử lý hấp tiêu độc xác gia cầm.
3.3.5. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Lấy mẫu: Sau khi mổ khám xong, lấy mẫu các tổ chức: gan, não, lách,
phổi, ruột…mẫu đƣợc cắt thành những miếng nhỏ hình chữ nhật hoặc tam giác sao cho tiết diện đủ cả phần trong và ngoài tổ chức, cho vào bình chứa đựng dung dịch Formol 10% (thể tích Formol gấp 9 lần thể tích bệnh phẩm), với tổ chức nổi (phổi) dùng gạc phủ lên trên.
* Làm tiêu bản vi thể:
- Lấy các miếng tổ chức cố định trong Formalin ra cắt mỏng 2-3mm, rửa dƣới vòi nƣớc chảy trong 2-3 giờ.
- Chuyển sang ngâm trong cồn 70% trong 2-3 giờ. - Ngâm sang cồn 90% trong 2-3 giờ.
- Ngâm sang cồn tuyệt đối 2-3 giờ. - Ngâm sang Xylen 1 để trong 2-3 giờ. - Ngâm sang Xylen 2 để trong 2-3 giờ. - Ngâm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2-3 giờ. - Đúc khuôn.
- Cắt tiêu bản:
+ Cắt gọt khối block nến vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá. + Đặt mặt khối block nến song song với mép lƣỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 2-5µm.
+ Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chƣng cất nhiệt độ nƣớc 30- 35°C, Dùng lam kính vớt dán lát cắt bằng Albumin (lòng trắng trứng gà), để khô.
- Nhuộm tiêu bản H&E
+ Tẩy nến trong Xylen 3 lần, mỗi lần 3-5 phút. + Ngâm trong cồn tuyệt đối 3-5 phút.
+ Ngâm sang cồn 90% để 3-5 phút. + Ngân sang cồn 70% để 3-5 phút. + Rửa dƣới vòi nƣớc chảy 3-5 phút.
+ Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin 1-2 phút tuỳ theo chất lƣợng của thuốc nhuộm và độ dày của tiêu bản. Sau khi nhuộm xong phải kiểm tra, nếu
tiêu bản bắt màu nhạt có thể nhùng nhanh tiêu bản qua dung dịch NaHCO3 1% để tiêu bản đậm hơn, nếu tiêu bản đậm có thể nhúng nhanh qua cồn axít clohydric (1 phần HCl –99 phần cồn Ethylic). Sau khi điều chỉnh màu, rửa sạch tiêu bản bằng nƣớc cất.
+ Rửa dƣới vòi nƣớc chảy 3-5 phút.
+ Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 60-90 giây tuỳ theo chất lƣợng của thuốc nhuộm và độ dày của tiêu bản. Nếu màu Eosin nhạt có thể cho vào dung dịch thuốc nhuộm Eosin 1-2 giọt axít axetic.
+ Để khô trong nhiệt độ phòng (hoặc ngâm trong cồn 90% và cồn tuyệt đối), chuyển sang Xylen 2 lần ( mỗi lần 2-3 phút), gắn lamen bằng Balm canada. Để khô, soi kính.
+ Soi kiểm tra dƣới kính hiển vi: từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao (từ 100 lần đến 400 lần).
3.3.6. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
3.3.6.1. Lấy mẫu
- Đối với gà đang sống, lấy mẫu dịch ngoáy họng, khí quản, lấy máu chắt huyết thanh.
- Đối với gà chết, mẫu cần lấy là: Khí quản, dịch khí quản; dịch rửa phế nang của phế quản; khí quản, phổi; các tổ chức phủ tạng khác: não, gan, lách, thận, tuyến tuỵ...
Bệnh phẩm sau khi lấy đƣợc cho vào dung dịch vận chuyển, có thể bảo quản ở 40
C từ 1-2 ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -700C.
3.3.6.2. Môi trường bảo quản bệnh phẩm
Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản đƣợc bảo quản trong dung dịch vận chuyển. Có thể sử dụng môi trƣờng 199 hoặc môi trƣờng glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu lâu nên giữ ở nhiệt độ -700
C.
3.3.6.3. Phương pháp xử lý mẫu
- Dịch ngoáy khí quản, hậu môn: Bệnh phẩm đƣợc làm ấm, lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc vortex mixer, bỏ tăm bông của ống dịch ngoáy, Bổ sung 1/10 lƣợng kháng sinh đậm đặc 10 lần và lắc đều. Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.Mẫu đã sẵn sàng để tiêm truyền.
dịch 10 % với dung dịch vận chuyển hoặc bằng PBS 0,01M pH = 7,2. Sau đó, bổ sung kháng sinh đậm đặc 10 lần theo tỉ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc độ 2.000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi.
3.3.7. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR phát hiện virus
a. Chuẩn bị
- Ống 25 µl Smart Cycler (catalog #900-0022 hoÆc 900-0003, Cepheid Smart Cycler, Sunnyvale, CA)
- Máy móc - dụng cụ : thiết bị lạnh, tủ ấm, máy ly tâm, pipet và máy nhân gen đƣợc kiểm tra và chứng nhận theo tiêu chuẩn.
- Chất sát trùng
- Nguyên liệu phản ứng/đối chứng - Primer
- Mẫu dò thủy phân - Cồn 70 %, cồn 80 %
- Cần - Mercaptoethanol ( - ME) bổ sung vào đệm Rneasy RLT trƣớc khi dùng
- Bổ sung cồn 100 % vào dung dịch đệm Rneasy RPE theo hƣớng dẫn của bộ kít
- Mẫu đối chứng dƣơng tính cho gen M, H5 có Ct nằmtrong dải cho phép - Pha loãng Rnase inhibitor đến 13,3 đơn vị/ml với nƣớc Rnase free - Chuẩn bị mẫu
- Chuẩn bị hạt nguyên liệu cho phản ứng phát hiện matrix và H5
(Mỗi hạt phải đủ dùng cho 4 phản ứng lƣợng 25l). Hoàn nguyên hạt (phát hiện M hoặc H5 cúm gia cầm), các hạt nguyên liệu này không chứa dNTP's, RNase inhibitor hoặc RT/PCR enzyme. Hỗn dịch Qiagen enzyme, dNTP's và RNase inhibitor sẽ đƣợc bổ sung sau bởi cán bộ xét nghiệm.
b. Thực hiện phản ứng
Trƣớc khi làm RT-PCR, đặt các pipet, khay, đầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tƣơng tự, đặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật đèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các
dụng cụ khác.
* Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Phương pháp Qiagen RNeasy)
- Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lƣợng 500l sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.
- Cho 500l Qiagen buffer RLT có - ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều