- Bằng kỹ thuật nuôi cấy tạo cụm tế bào (colony assay) sử dụng bộ kít theo quy trình chuẩn của hãng Stem Cells-Canada (quy trình 6, phụ lục 3), cụ
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: rã đông ở 37 C trong 30 phút. Thể
tích môi trường cần thiết 3,5-4 ml/mẫu nuôi cấy.
+ Chuẩn bị huyền dịch tế bào, điều chỉnh về nồng độ phù hợp theo từng loại mẫu bằng huyết tương tự thân:
Dịch tủy xương : 5x104 tế bào/ml
Máu ngoại vi : 1x105 tế bào/ml
Máu dây rốn : 1x105 tế bào/ml
+ Trộn huyền dịch tế bào với dung dịch môi trường nuôi cấy, tỷ lệ về
thể tích là 1:10.
+ Trộn (vortex) kỹ để tế bào phân bố đều trong môi trường nuôi cấy
+ Đặt hỗn dịch nuôi cấy trong 10 phút đểđuổi bọt khí
+ Phân phối 1ml hỗn dịch nuôi cấy vào từng đĩa nuôi cấy. Tổng số 3
đĩa/mẫu nuôi cấy.
+ Nuôi cấy trong tủấm 370C có 5% CO2 trong 14 ngày
- Tiêu chuẩn đánh giá các cụm hình thành: các cụm tế bào hình thành được
đếm và định loại sau 14 ngày nuôi cấy, cụ thể:
+ Cụm tế bào đa dòng (CFU-GEMM): có trên 20 tế bào, gồm cả các tế bào có màu hồng của hemoglobin và các tế bào bạch cầu màu trắng sáng, kích thước không đồng đều, phân bố lan tỏa.
+ Cụm tế bào hỗn hợp dòng hạt-mono (CFU-GM): có trên 20 tế bào, màu trắng sáng, kích thước không đều, lan tỏa
+ Cụm tế bào dòng mono (CFU-M): có trên 20 tế bào, màu trắng sáng, kích thước lớn, khá đều, phân bố lan tỏa mạnh.
+ Cụm tế bào dòng hạt (CFU-G): có trên 20 tế bào, màu trắng sáng, kích thước nhỏ, khá đều, phân bố tập trung.
thường quy của Labo Miễn dịch, Viện Huyết học-Truyền máu TW, tóm tắt như sau:
- Các mẫu tế bào sau khi thu gom được tiến hành tách lớp bạch cầu đơn nhân, sử dụng ficoll tỷ trọng 1.077.
- Huyền dịch tế bào được ủ với các kháng thể đơn dòng (như trên) trong thời gian ít nhất 1h. - Phá hồng cầu bằng dung dịch ly giải hồng cầu trong 30 phút. - Ly tâm rửa cặn bạch cầu 3 lần bằng dung dịch đệm PBS - Trải cặn bạch cầu trên các tiêu bản, tiến hành đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang, xác định tỷ lệ từng loại các dưới nhóm bạch cầu. 2.2.3. Các biến số nghiên cứu
- Trong quá trình thu gom:
+ Số lượng tế bào máu, tế bào miễn dịch, tế bào CD34 và khả năng tạo cụm tế bào của các mẫu sau khi thu gom.
+ Số lượng tế bào CD34 ở máu ngoại vi trong quá trình huy động bằng G-CSF.
+ Biểu hiện lâm sàng, chỉ số huyết học, hóa sinh của người cho trong quá trình huy động bằng G-CSF và quá trình tách tế bào.
+ Một số đặc điểm trẻ sơ sinh và bà mẹ cho máu dây rốn - Trong quá trình xử lý: với từng phương pháp
+ Thể tích mẫu trước và sau xử lý
Trong quá trình bảo quản dài ngày:
-
Tỷ lệ tế bào sống sau quá trình bảo quản.
+
Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông
+
2.3. ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU
Quy trình thu gom mẫu máu ngoại vi và dịch tủy xương được tiến hành tại Viện Huyết học-Truyền máu TW. Các mẫu máu dây rốn được thu gom tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội và bệnh viện Bạch Mai.
-
- Quy trình xử lý loại bỏ hồng cầu trong các mẫu tế bào gốc, kỹ thuật xác
định tế bào miễn dịch bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang trực tiếp và khả năng tạo cụm tế bào được tiến hành tại các Labo của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.
- Quy trình bảo quản dài ngày và rã đông các mẫu tế bào gốc tạo máu
được tiến hành tại khoa Huyết học và khoa Truyền máu, bệnh viện trung
ương quân đội 108.
- Kỹ thuật đếm tế bào CD34 được thực hiện tại khoa Huyết học, bệnh viện trung ương quân đội 108.
- Các xét nghiệm đếm tế bào máu, các chỉ sốđông máu cơ bản và hóa sinh khác được tiến hành theo các quy trình thường quy tại các labo của Viện Huyết học-Truyền máu TW.
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu thu thập được xử lý bằng toán thống kê y sinh học để tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn. Sử dụng các thuật toán để so sánh các giá trị trung bình và tính toán các mối tương quan.
-
Sử dụng các phần mềm thống kê y học: EPI-INFO 6.04 và SPSS 13. -
Chúng tôi cam kết chỉ thực hiện thu thập mẫu nghiên cứu khi được sựđồng ý của những người cho và sản phụ tình nguyện, sau khi đã giải thích rõ mục
đích, các bước tiến hành và những tác dụng không mong muốn có thể xảy ra. Việc thu thập mẫu không ảnh hưởng đến sức khỏe của người cho, của sản phụ cũng như trẻ sơ sinh. Các thông tin về mẫu nghiên cứu được đảm bảo bí mật. Và trên hết chúng tôi tiến hành nghiên cứu mục đích cung cấp những thông tin hữu ích, đầy đủ hơn để tiến tới cung cấp nguồn tế bào gốc an toàn, hiệu quả cao phục vụ cho nhu cầu ghép tế bào gốc điều trị nhằm đem lại hạnh phúc cho nhiều bệnh nhân hơn nữa.