Cho quá trình thu gom:
- Bộ dụng cụ chọc tủy gồm: kim chọc tủy (loại sử dụng nhiều lần) cỡ
11G, bơm kim tiêm loại 5 và 10ml, các ống nghiệm lấy mẫu.
- Máy tách tế bào tự động COBE-Spectra sử dụng để tách tế bào CD34 từ máu ngoại vi và bộ kit tách tế bào kèm theo (Gambro, Mỹ).
- Yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt (G-CSF, hoạt chất Filgrastim, biệt dược Leukokin, Hàn quốc): dùng để huy động tế bào CD34 từ tủy ra máu ngoại vi.
- Bộ dụng cụ thu gom máu dây rốn: Túi chất dẻo 250 ml (Terumo, Nhật Bản) đã bỏ bớt chất chống đông và nuôi dưỡng hồng cầu (còn 10-12 ml/túi). Bộ dụng cụ sát khuẩn, kẹp không mấu, kéo, các ống nghiệm lấy mẫu và hộp bảo quản máu dây rốn sau thu gom.
Cho quá trình xử lý:
- Máy ly tâm túi máu (Sorval, Mỹ)
- Máy ly tâm lạnh ống máu (Hitachi, Nhật Bản)
- Bàn ép huyết tương (Terumo, Nhật Bản), kẹp túi máu.
- Pipette tự động 100-1000 μl và đầu côn phù hợp (Eppendoft, Đức) - Dung dịch hydroxyethyl starch (HES) 6% và dung dịch RPMI 1640.
Cho quá trình bảo quản dài hạn và rã đông
- Tủ sinh học vô trùng cấp II (Thermo, Mỹ)
- Máy hạ nhiệt độ theo chương trình (Krypton, Anh) - Hệ thống bình bảo quản và cấp Nito lỏng (MVE, Mỹ)
- Chất bảo quản: Dimethyl sulfoxide (DMSO 100%, Sigma-Mỹ) và hydroxyethyl starch (HES) 10% (B-Braun, Đức)
- Túi bảo quản chuyên dụng thể tích 50ml (Gambro, Mỹ) - Bể ấm 370C (bain-marrie), chậu nước đá đang tan.
Để đánh giá các chỉ số nghiên cứu:
- Máy đếm tế bào CD34 FACS Callibur (Mỹ): sử dụng để đếm tế bào CD34.
- Máy đếm tế bào máu tự động XT-2000i (Nhật). - Máy đông máu tự động ACL200 (Italia)
- Máy hóa sinh tựđộng HITACHI 902 (Nhật Bản). - Kính hiển vi huỳnh quang Nikon (Nhật)
- Kính hiển vi đảo ngược (Leica, Đức) - Tủ ấm CO2 (Thermo, Mỹ).
- Bộ panel kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang: anti-CD3/19, anti-4/8 và anti-16/56 (Becton-Dickinson, Mỹ).
Hình 2.1.Máy tách tế bào COBE-Spectra
Hình 2.3. Máy hạ nhiệt độ theo chương trình có kiểm soát Krypton
(Controlled Rate Freezer)
được lựa chọn theo các tiêu chuẩn đã mô tả như trên với quy trình khác nhau theo từng nguồn cung cấp, cụ thể:
Thu gom từ máu ngoại vi
- Không huy động: tiến hành tách trực tiếp từ tĩnh mạch người cho bằng máy COBE-Spectra.
- Có huy động: theo quy trình của Stroncek và cộng sự [150].
+ Huy động tế bào CD34 bằng G-CSF (Filgrastim, Leukokine), tiêm dưới da bụng với liều 10mcg/kg/ngày trong 5 ngày liên tiếp, tiêm 1 lần vào buổi sáng. Đếm số lượng tế bào CD34 hàng ngày và tiến hành thu tế bào gốc vào ngày thứ 5 và thứ 6 kể từ ngày bắt đầu huy
động bằng máy tách COBE-Spectra.
+ Theo dõi biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm của người cho trong suốt quá trình nghiên cứu: Trước và trong khi huy động, trước và sau khi tách 1 tuần và theo dõi sức khoẻ trong 12 tháng kể từ lần cho cuối cùng.
Thu gom từ tủy xương: bằng kỹ thuật chọc hút tủy ở gai chậu sau trên. - Gây tê tại chỗ bằng Lidocain 2%.
- Tiến hành chọc tủy và hút dịch tủy theo nhiều hướng khác nhau, mỗi lần hút với thể tích khoảng 2-3ml.
- Dịch tủy được chống đông bằng Heparin tiêu chuẩn tráng trong bơm tiêm
để hút.
+ 1ml: đếm số lượng tế bào máu
+ 1ml: đếm số lượng tế bào miễn dịch
+ 3ml: nuôi cấy cụm tế bào
+ Thể tích còn lại được pha loãng bằng RPMI 1640 với tỷ lệ 1:1 về
thể tích để tiến hành xử lý.
Thu gom máu dây rốn:
- Vận động bà mẹ tình nguyện cho máu dây rốn: Rau thai và phần phụ của thai thường được xem là sản phẩm bỏđi và có thể vứt bỏ. Như vậy thường
được xem là tài sản của bệnh viện, không thuộc sở hữu của bà mẹ và đứa trẻ. Tuy nhiên xét về khía cạnh đạo đức trước khi tiến hành lấy máu dây rốn cần phải được sựđồng ý của sản phụ bằng phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu.
- Tiến hành ngay sau khi đẻ thai và tiếp tục thu gom máu còn lại sau khi đẻ
rau bằng cách ép bánh rau để thu thể tích máu tối đa. - Quy trình thu gom máu dây rốn:
+ Ngay sau khi đẻ thai 6-10 giây dùng 2 panh không mấu kẹp đoạn dây rốn ở khoảng cách 5-6 cm tính từ thai, cắt dây rốn ở giữa 2 panh đã kẹp, luồn kim của túi lấy máu vào tĩnh mạch rốn, máu dây rốn sẽ chảy vào túi theo trọng lực.
+ Khi máu ngừng chảy, tiếp tục luồn kim vào vị trí khác ở phía trên khoảng 2-3 cm để tiếp tục thu gom.
+ Sau khi rau bong máu không còn chảy vào túi nữa, tiến hành đỡ rau, treo rau lên giá đỡ và tiếp tục thu gom máu còn lại.
+ Lắc đều túi máu cho vào hộp bảo quản chuyển về phòng xét nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành xử lý trong vòng 24h
+ Lựa chọn các túi máu dây rốn có thể tích ≥ 90 ml (đã trừ chất chống đông) sử dụng cho mục đích bảo quản dài ngày.