Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại rau quả. Hiện nay, ở Việt Nam có gần 80 nhà máy chế biến rau quả với tổng công suất khoảng 200 tấn/năm và gần 140 nhà máy chế
biến nước giải khát. Lượng bã thải của quá trình chế biến quả là rất lớn. Cho đến nay hầu như các phế thải từ quả và các bã quảđều không được xử lý trước khi thải
ra môi trường. Vấn đề tận dụng nguồn phế thải vỏ quả trong công nghiệp chế biến
nước giải khát nhằm tăng nguồn thu, tạo sản phẩm mới và giảm ô nhiễm môi
trường, giảm chi phí nhập khẩu một lượng lớn pectin hàng năm là nhu cầu cấp thiết của các nhà sản xuất.
• Vỏ quả chanh dây:
Chanh dây là cây leo thân gỗ, thuộc họ Passifloraceae và có nguồn gốc từ
Brazil. Chanh dây vào Việt Nam có hai giống, phân biệt bằng xuất xứ và màu vỏ. Giống chanh dây vỏ vàng có nguồn gốc từ Sirilanca, Urganda và Hawaii có mặt ở
Việt Nam với tên gọi là chanh dây hay lạc tiên. Giống chanh dây vỏ tím có nguồn gốc từ Australia và Đài Loan, có tên khoa học là Passiflora edulis, trong đó thịt quả
chỉ chiếm 26- 48%, vỏ quả chiếm 46-64%, còn lại là hạt. Trong vỏ quả chanh dây, hàm lượng pectin chiếm khoảng 2-3%.
- 19 -
Nguyễn Hồng Ly
Hình 1.12. Quả chanh dây tím và chanh dây vàng
Chanh dây được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam như trên địa bàn tỉnh Đăk
Nông diện tích trồng khoảng 2 000 ha, ở Đăk Lăk cũng vào khoảng 300 ha. Vài
năm gần đây diện tích trồng loại cây này cũng tăng nhanh ở một số tỉnh phía bắc
như Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An với năng suất đạt từ 40-50 tấn/ha. Nhiều cơ
sở sản xuất, chế biến loại quảnày đã được xây dựng cung cấp cho thị trường trong
và ngoài nước những sản phẩm như nước chanh dây cô đặc, pure lạc tiên hoặc nước lạc tiên,...Ví dụở Đăk Nông có 8 cơ sởsơ chế, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ khoảng 50 tấn chanh dây tươi/ngày cho hai Công ty cung ứng giống là Chia Meei (Đài Loan) và Trường Hoàng (Lâm Đồng). Do vậy, nguồn vỏ quả thải ra từ quá trình chế biến này là rất lớn và khá tập trung đảm bảo cho việc tận thu nguồn pectin từ nguồn phụ
phẩm này.
•Các phương pháp thu nhận pectin từ vỏ quả chanh dây
a, Phương pháp hoá học [2, 11, 19, 36]
Trong cấu tạo của thành tế bào thực vật gồm chủ yếu là những lớp mỏng cellulose liên kết với những lớp mỏng hemicellulose bằng những cầu nối pectin và lignin và một số hợp chất khác, dùng tác nhân axit ở nhiệt độ cao sẽ thuỷ phân cellulose và hemicellulose giải phóng pectin. Do monome cấu thành nên pectin có khối lượng phân tử lớn và liên kết chặt chẽ nên ở điều kiện trên pectin không bị
phân huỷ. Lợi dụng tính chất dễ hoà tan trong nước của pectin, nhất là điều kiện
nước nóng ta thu dịch thuỷ phân bằng cách loại bỏ bã, sau đó thu pectin bằng cách
- 20 -
Nguyễn Hồng Ly
b, Phương pháp enzym [23, 39]
Sử dụng tác nhân thuỷ phân cellulose trong cấu trúc thành tế bào thực vật là cenllulase, glucanase và protopectinase ở điều kiện thích hợp các liên kết glucoside trong phân tử cellulose bị phân cắt thành những đoạn nhỏ hoặc những phân tử
glucose, giải phóng ra pectin. Thu dịch trong bằng cách lọc loại bỏ bã rồi kết tủa bằng ethanol được sản phẩm pectin thô.
1.3 Giới thiệu chung về enzym thủy phân pectin từ chanh dây tạo POS 1.3.1 Sơ lược về hệ enzym pectinase
Enzym pectinase là một nhóm enzym thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là galacturonic acid, galactose, methanol. Pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá. Trong các loại khác chỉ có pectinesterase. Chúng cũng có thể được chiết xuất từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “ thao tác trên gen” trên chủng Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng hợp các enzym phân giải pectin.
Pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất chiết thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong nước quả, rượu vang...(Nilay Demir et al, 2000).
- 21 -
Nguyễn Hồng Ly
Hình 1.13. Phân loại enzym pectinase
a. Nhóm hydrolase:
- Pectinesterase (PE): hay còn gọi là pectinmethylesterase, pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase, pectolipase, thuộc nhóm enzym thủy phân. PE xúc tác quá trình thủy phân liên kết este để tách nhóm methoxyl (-OCH3) trong phân tử polygalacturonic acid, giải phóng ra methanol và pectic acid. PE được ứng dụng đểlàm trong nước quả trong sản xuất rượu vang, sâm panh.
- Polygalacturonase (PG): hay còn gọi là poly-1,4-galacturonide glucanohydrolase. Là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong phân tử pectin. PG là một phức hệ gồm nhiều cấu tửvà thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Dựa
vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng người ta chia PG làm các nhóm:
- 22 -
Nguyễn Hồng Ly
• Endo- polygalacturonase : thủy phân ngẫu nhiên liên kết α- glucoside bên trong chuỗi polygalacturonic acid tạo sản phẩm chủ yếu là pectic oligosaccharide và một ít galacturonic acid.
• Exo- polygalacturonase : phân cắt chuỗi polygalacturonic acid từ đầu không khử tạo sản phẩm chủ yếu là galacturonic acid và một lượng nhỏ pectic oligosaccharide.
- Polymethylgalacturonase (PMG): hay còn gọi là α-1,4-galacturonite
methylesglucanohydrolase, tác động chủ yếu lên các ester đã methyl hóa 2/3 của polygalacturonic acid. Các enzym này được phân làm hai nhóm nhỏ tùy theo liên kết glucoside bị cắt:
+ Endo-polymethyl galacturonase: phân cắt liên kết 1,4-glucoside ở bên trong mạch pectin có mức độ methyl hóa cao.
+ Exo-polymethyl galacturonase: phân cắt liên kết glucoside ở đầu mạch nằm giữa hai gốc galacturonic đã được methyl hóa.
b. Nhóm Transeliminase (TE):
Enzym này xúc tác chuyển hóa pectin theo cơ chế trans- tạo liên kết đôi
trong gốc galacturonic acid giữa nguyên tử C số 4 và 5. Nhóm này bao gồm một số
enzym sau:
• Endo-polygalacturo-lyase: hay còn gọi là Endo-pectatlyase. Enzym này phân cắt liên kết α-1,4-glucoside ở giữa chuỗi theo cơ chế trans để tạo liên kết đôi giữa nguyên tử C số 4 và 5 trong gốc galacturonic acid (dạng không no).
Enzym này chỉ hoạt động khi có mặt Ca2+, pH tối ưu 8-10.
• Exo- polygalacturo-lyase: hay còn gọi là Exo- pectatlyase. Enzym này phân cắt liên kết α-1,4-glucoside ở đầu chuỗi theo cơ chế trans để tạo liên kết đôi giữa nguyên tử C số 4 và 5 trong gốc galacturonic acid (dạng không no). Enzym này hoạt động trong khoảng pH tối ưu 8-9.5.
- 23 -
Nguyễn Hồng Ly
• Endo-polymethylgalacturo-lyase: Enzym này phân cắt liên kết α-1,4- glucoside ở bên trong chuỗi polymethylgalacturonic tạo các oligomethylgalacturonic không no.
Trong số các enzym trên thì Endo- polygalacturonase là enzym có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và có khả năng thủy phân pectin từ nguồn vỏ
quả tạo pectic oligosaccharide (POS), một nguồn prebiotic tốt cho sức khỏe con
người.
1.3.2. Giới thiệu về Endo- polygalacturonase (EC 3.2.1.15)
Endo- polygalacturonase (EPG) là enzym đã được nghiên cứu trên nhiều đối
tượng khác nhau: thực vật, nấm mốc, vi khuẩn. Đã có nhiều báo cáo được công bố
về sinh tổng hợp cảm ứng pectinase trên các đối tượng: Fusarium oxysporum, Aspergillus japonicus, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus awamori, Aspergillus pulverulentus, Penicillium viridicatum, Trichoderma reesei, Sclerotinia sclerotiorum,...Tuy nhiên, đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger.
1.3.2.1. Cấu tạo Endo- polygalacturonase
EPG cũng như hầu hết các enzym khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu cơ chất cao. EPG có phân tửlượng khác nhau (38-65 kDa) thùy thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật tổng hợp enzym. EPG từA.niger chứa một vùng 8-10 vòng xoắn β kép về phía phải với 2 vòng sẽ tạo thành một khe liên kết với cơ chất. Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này chứa hai acid amin là Aspartate và Lysine.Một acid amin Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽảnh hưởng đến khảnăng xúc tác của enzym.
- 24 -
Nguyễn Hồng Ly
Hình 1.15.Cấu trúc của Endo-polygalacturonase từ A.niger
1.3.2.2. Tính chất và cơ chế tác dụng của Endo- polygalacturonase
EPG có đặc tính khác nhau về khối lượng phân tử, điểm đẳng điện pI, nhiệt độ
tối ưu và pH tối ưu tùy thuộc vào nguồn thu enzym. Tuy nhiên nhiệt độ phản ứng enzym tối ưu nằm trong khoảng 40-50°C và pH nằm trong vùng acid yếu.
Bảng 1.2. Đặc tính của EPG [7] Nguồn gốc Loại EPG Phân tửlượng (kDa) pI Top (°C) pHop Aspergillus japonicus I 38 5.6 30 4.0-5.5 II 65 3.3 30 4.0-5.5 Aspergillus oryzae 41 - 45 5.0 Thermococcus aurantiacus 35 5.9 55 5.0 Aspergillus niger I 61 - 43 3.8-4.3 II 38 - 45 3.0-4.6 Aspergillus awamori 41 6.1 40 5.0 Aspergillus alliaceus 40 5.9 35 5.5 Sclerotinia borealis 40 7.5 40-50 5.0 Saccharomyces cerevisiae 39 - 45 5.5
(EPG I- Endo polygalacturonase thủy phân pectin tạo POS có nhiều nhóm methyl, EPG II-Endo polygalacturonase thủy phân tạo POS có ít nhóm methyl).
- 25 -
Nguyễn Hồng Ly
Endo polygalacturonase là enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao. EPG chỉ phân cắt trên phân tử pectin tại liên kết α-1,4-glucoside đứng cạnh nhóm COOH. Các EPG phân cắt pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ nhớt của dung dịch cơ
chất.
Hình 1.16. Cơ chế hoạt động của Endo polygalacturonase.
1.3.2.3. Ứng dụng của Endo polygalacturonase
Hiện nay, Endo Polygalacturonase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như: sản xuất nước quả, rượu vang, lên men trà và cà phê, sản xuất tinh dầu và trong ngành công nghiệp khác như: công nghiệp dệt, xử lý nước thải, sản xuất thức ăn chăn nuôi [3].
Pollard và Kieser (1959) phát hiện ra rằng một EPG được sản sinh bởi một loại nấm men không xác định trong quá trình lên men nước táo có khả năng làm
trong dịch rượu vang bằng cách kết hợp với pectin methylesterase có nguồn gốc từ
quả táo [47].
Ngoài ra, Endo polygalacturonase còn được nghiên cứu làm chỉ thị xác định quả chín và quả bị tổn thương [14].
- 26 -
Nguyễn Hồng Ly
1.4. Các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS
•Nghiên cứu ngoài nước
Cho tới nay, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố về các
điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS.
Sabajanes và cộng sựdưới các điều kiện lựa chọn (37oC, pH 5) thủy phân pectin từ vỏ cam sau 20 giờthu được 13 kg POS/100kg nguyên liệu [28]
Nhóm nghiên cứu của Concha (2012) cũng đã tiến hành nghiên cứu chiết rút pectin từ bã củ cải đường để sản xuất POS [24].
Nikolic và cộng sự thủy phân pectin từ táo ở điều kiện (1% pectin, enzym 162U/l, pH 4.5, 50oC) sau 12 giờ đạt hiệu suất thủy phân khoảng 29% trong đó
dạng trime chiếm 28,4%. Trong đó giá trị pH tối ưu của polygalacturonase được sử
dụng là 4.5 nằm trong khoảng pH tối ưu đã khảo sát là 3.8-5.0, nhiệt độ tối ưu là
400C trong khoảng nhiệt độ tối ưu đã khảo sát là 20-60oC [27]
Trên nguồn cơ chất pectin củ cải đường Martinez và cộng sựđã thí nghiệm trên mô hình tối ưu cho thấy sử dụng hỗn hợp Polygalacturonase 10 U/g pectin, Cellulase 0,725 U/g trong 12,8 giờ từ 100 kg pectin thu được 26,7 kg oligosaccharide [32].
Trong một paten (European patent. EP 0 868 854 A2) các nhà nghiên cứu đã
thủy phân dịch pectin 3% lần lượt với 3 loại enzym (PL, PG và PE) thu được hỗn hợp các pectic oligosaccharide với mức độ trùng hợp nằm trong khoảng từ2 đến 10
đạt hiệu suất gần 67% [18]
Nikolic và cộng sự cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy
phân pectin táo trong đó enzym PG có nhiệt độ tối ưu là 40oC, trong khoảng 30- 40oC, hoạt độ enzym tăng theo cấp số nhân, tuy nhiên ở 50oC hoạt độ giảm nhanh.
Combo và cộng sự đã tiến hành thủy phân 0.2% polygalacturonic acid bằng endo - polygalacturonase trong 2 giờ ở 40oC tại pH 5.5, thu được các oligo có hàm
lượng DP 3> DP 2> DP 1 lần lượt là 58%, 18% và 13%. Tác giảcũng đã tiến hành thử nghiệm với sáu loại enzym thương phẩm (Endopolygalacturonase M2,
- 27 -
Nguyễn Hồng Ly
Pectinase, Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L, Pectinase 62L và Macer8 FJ) để
thủy phân pectin tạo POS. Kết quả phân tích dịch thủy phân bằng sắc kí trao đổi anion với detector điện hóa (HPEAC-PAD) cho thấy cả sáu chế phẩm đều tạo ra các oligogalacturonic với các mức độ trùng hợp khác nhau và Endopolygalacturonase M2 cho hiệu suất tạo POS cao nhất 76% [4].
Các nghiên cứu trên cho kết quả thủy phân khác nhau là do các nguyên nhân
như: sử dụng các nguồn cơ chất có nguồn gốc khác nhau, mức độ methyl hóa khác nhau, sử dụng các enzym khác nhau, các thông số kỹ thuật khác nhau… Vì vậy, có thể đưa ra các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS bao gồm các thông số
công nghệ được kiểm soát như nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, tốc
độ khuấy,...
•Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam hiện nay, hướng nghiên cứu về POS còn khá mới và chưa có
nhiều công trình khoa học được công bố. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thu nhận pectin, thu nhận enzym pectinase và endo polygalacturonase chứ chưa có nghiên cứu nào công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS nhờ
enzym. Với những đặc tính rất hữu ích đã trình bày ở trên, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu một cách có hệ thống đầy đủ về các điều kiện thủy phân pectin tạo pectic oligosaccharide bằng Endo-polygalacturonase.
- 28 -
Nguyễn Hồng Ly
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu
- Vỏchanh dây được thu thập từ các chợđầu mối hoa quảtrên địa bàn Hà Nội. - Chủng Lactobacillus rhamnosus GG (L1), L. amylovorus DSM16698 (L2), L. acidophilus NCFM (L3), L. reuteri DSM 17938 (L4), L. casei Shirota (L5), L. bulgaricus CH-3 (L6), L. fermentum PCC (L7), L. plantarum 299V (L8), L. johnsonii La1 (L9), Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp. enterica
serotype Typhi ATCC 19430 (S. typhi ATCC) và Staphylococcus aureus ATCC 25923từ bộsưu tập giống của Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất chính và enzym
- Polygalacturonase (Sigma, Mỹ).
- Pectinex Ultra SPL, Pectinex 3 XL (Novozymes).
- Polygalacturonic acid, Monogalacturonic acid (G1), Digalacturonic acid (G2), Trigalacturonic acid (G3) (Sigma, Mỹ).
- 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS), bacto peptone, bacto agar, D-galactose (Merck) - Meat extract, yeast extract (HiMedia)
- CaCl2 2N - NaOH 0.1N - CH3COOH 1N - Ethanol 99%(v/v) - HCl 1%
2.1.3 Môi trường và các dung dịch sử dụng
Môi trường LB (Luria – Bertani)
- Trypton: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l - NaCl: 10g/l
29
Nguyễn Hồng Ly
Môi trường MRS (Man Rogosa Sharpe)
- Pepton: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l - Cao thịt: 5g/l - Glucose: 20g/l - Amonicitrat: 2g/l - CH3COONa : 5g/l - K2HPO4 : 2g/l - MgSO4.7H2O: 0.1g/l - MnSO4.4H2O: 0.05g/l - Agar: 15g/l - Nước cất - pH 6.5 Dung dịch đệm pH = 4 - C6H8O7.H2O : g/l - C6H5O7.Na3.2H2O: g/l - Nước cất Dung dịch chạy sắc ký TLC:
- Dung môi butanol: acetic acid: nước tỷ lệ 9:4:7
- Dung dịch hiện màu H2SO4 5% pha trong cồn tuyệt đối
2.1.4. Thiết bị
- Bểổn nhiệt (Pharmđecia Biotech, Thụy Điển) - Máy vortex (Bio Cote, Đức)
- Máy khuấy từ (RotoLab, Thụy Sĩ)
- Máy ly tâm lạnh Micro Centrifuge II (Daihan Labtech, Đức)
- Máy so màu quang phổ UV-VIS Ultrospec (Pharmacia Biotech, Thụy Điển) - Bản mỏng sắc ký 20x20 (Merk, Đức)
- Máy đo pH, cân điện tử (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)
- Nồi hấp tiệt trùng (Hirayama, Nhật) - Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật) - Tủấm (Memment, Đức)
30
Nguyễn Hồng Ly
2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Phương pháp hóa học 2.2.1 Phương pháp hóa học
2.2.1.1 Tách chiết pectin từ chanh leo bằng axit citric
- Vỏchanh leo được rửa sạch bằng nước máy, cắt nhỏ và chần bằng dung dịch axit