•Nghiên cứu ngoài nước
Cho tới nay, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố về các
điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS.
Sabajanes và cộng sựdưới các điều kiện lựa chọn (37oC, pH 5) thủy phân pectin từ vỏ cam sau 20 giờthu được 13 kg POS/100kg nguyên liệu [28]
Nhóm nghiên cứu của Concha (2012) cũng đã tiến hành nghiên cứu chiết rút pectin từ bã củ cải đường để sản xuất POS [24].
Nikolic và cộng sự thủy phân pectin từ táo ở điều kiện (1% pectin, enzym 162U/l, pH 4.5, 50oC) sau 12 giờ đạt hiệu suất thủy phân khoảng 29% trong đó
dạng trime chiếm 28,4%. Trong đó giá trị pH tối ưu của polygalacturonase được sử
dụng là 4.5 nằm trong khoảng pH tối ưu đã khảo sát là 3.8-5.0, nhiệt độ tối ưu là
400C trong khoảng nhiệt độ tối ưu đã khảo sát là 20-60oC [27]
Trên nguồn cơ chất pectin củ cải đường Martinez và cộng sựđã thí nghiệm trên mô hình tối ưu cho thấy sử dụng hỗn hợp Polygalacturonase 10 U/g pectin, Cellulase 0,725 U/g trong 12,8 giờ từ 100 kg pectin thu được 26,7 kg oligosaccharide [32].
Trong một paten (European patent. EP 0 868 854 A2) các nhà nghiên cứu đã
thủy phân dịch pectin 3% lần lượt với 3 loại enzym (PL, PG và PE) thu được hỗn hợp các pectic oligosaccharide với mức độ trùng hợp nằm trong khoảng từ2 đến 10
đạt hiệu suất gần 67% [18]
Nikolic và cộng sự cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy
phân pectin táo trong đó enzym PG có nhiệt độ tối ưu là 40oC, trong khoảng 30- 40oC, hoạt độ enzym tăng theo cấp số nhân, tuy nhiên ở 50oC hoạt độ giảm nhanh.
Combo và cộng sự đã tiến hành thủy phân 0.2% polygalacturonic acid bằng endo - polygalacturonase trong 2 giờ ở 40oC tại pH 5.5, thu được các oligo có hàm
lượng DP 3> DP 2> DP 1 lần lượt là 58%, 18% và 13%. Tác giảcũng đã tiến hành thử nghiệm với sáu loại enzym thương phẩm (Endopolygalacturonase M2,
- 27 -
Nguyễn Hồng Ly
Pectinase, Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L, Pectinase 62L và Macer8 FJ) để
thủy phân pectin tạo POS. Kết quả phân tích dịch thủy phân bằng sắc kí trao đổi anion với detector điện hóa (HPEAC-PAD) cho thấy cả sáu chế phẩm đều tạo ra các oligogalacturonic với các mức độ trùng hợp khác nhau và Endopolygalacturonase M2 cho hiệu suất tạo POS cao nhất 76% [4].
Các nghiên cứu trên cho kết quả thủy phân khác nhau là do các nguyên nhân
như: sử dụng các nguồn cơ chất có nguồn gốc khác nhau, mức độ methyl hóa khác nhau, sử dụng các enzym khác nhau, các thông số kỹ thuật khác nhau… Vì vậy, có thể đưa ra các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS bao gồm các thông số
công nghệ được kiểm soát như nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, tốc
độ khuấy,...
•Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam hiện nay, hướng nghiên cứu về POS còn khá mới và chưa có
nhiều công trình khoa học được công bố. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thu nhận pectin, thu nhận enzym pectinase và endo polygalacturonase chứ chưa có nghiên cứu nào công bố về công nghệ thủy phân pectin tạo POS nhờ
enzym. Với những đặc tính rất hữu ích đã trình bày ở trên, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu một cách có hệ thống đầy đủ về các điều kiện thủy phân pectin tạo pectic oligosaccharide bằng Endo-polygalacturonase.
- 28 -
Nguyễn Hồng Ly
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu
- Vỏchanh dây được thu thập từ các chợđầu mối hoa quảtrên địa bàn Hà Nội. - Chủng Lactobacillus rhamnosus GG (L1), L. amylovorus DSM16698 (L2), L. acidophilus NCFM (L3), L. reuteri DSM 17938 (L4), L. casei Shirota (L5), L. bulgaricus CH-3 (L6), L. fermentum PCC (L7), L. plantarum 299V (L8), L. johnsonii La1 (L9), Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp. enterica
serotype Typhi ATCC 19430 (S. typhi ATCC) và Staphylococcus aureus ATCC 25923từ bộsưu tập giống của Bộ môn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất chính và enzym
- Polygalacturonase (Sigma, Mỹ).
- Pectinex Ultra SPL, Pectinex 3 XL (Novozymes).
- Polygalacturonic acid, Monogalacturonic acid (G1), Digalacturonic acid (G2), Trigalacturonic acid (G3) (Sigma, Mỹ).
- 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS), bacto peptone, bacto agar, D-galactose (Merck) - Meat extract, yeast extract (HiMedia)
- CaCl2 2N - NaOH 0.1N - CH3COOH 1N - Ethanol 99%(v/v) - HCl 1%
2.1.3 Môi trường và các dung dịch sử dụng
Môi trường LB (Luria – Bertani)
- Trypton: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l - NaCl: 10g/l
29
Nguyễn Hồng Ly
Môi trường MRS (Man Rogosa Sharpe)
- Pepton: 10g/l - Cao nấm men: 5g/l - Cao thịt: 5g/l - Glucose: 20g/l - Amonicitrat: 2g/l - CH3COONa : 5g/l - K2HPO4 : 2g/l - MgSO4.7H2O: 0.1g/l - MnSO4.4H2O: 0.05g/l - Agar: 15g/l - Nước cất - pH 6.5 Dung dịch đệm pH = 4 - C6H8O7.H2O : g/l - C6H5O7.Na3.2H2O: g/l - Nước cất Dung dịch chạy sắc ký TLC:
- Dung môi butanol: acetic acid: nước tỷ lệ 9:4:7
- Dung dịch hiện màu H2SO4 5% pha trong cồn tuyệt đối
2.1.4. Thiết bị
- Bểổn nhiệt (Pharmđecia Biotech, Thụy Điển) - Máy vortex (Bio Cote, Đức)
- Máy khuấy từ (RotoLab, Thụy Sĩ)
- Máy ly tâm lạnh Micro Centrifuge II (Daihan Labtech, Đức)
- Máy so màu quang phổ UV-VIS Ultrospec (Pharmacia Biotech, Thụy Điển) - Bản mỏng sắc ký 20x20 (Merk, Đức)
- Máy đo pH, cân điện tử (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)
- Nồi hấp tiệt trùng (Hirayama, Nhật) - Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật) - Tủấm (Memment, Đức)
30
Nguyễn Hồng Ly
2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1 Phương pháp hóa học 2.2.1 Phương pháp hóa học
2.2.1.1 Tách chiết pectin từ chanh leo bằng axit citric
- Vỏchanh leo được rửa sạch bằng nước máy, cắt nhỏ và chần bằng dung dịch axit citric 5% trong 3 phút sau đó được đem nghiền mịn.
- Bổ sung nước vào phần vỏ đã nghiền theo tỉ lệ 1kg vỏ : 3 kg nước rồi tiến hành bổ sung axit citric cho tới khi hỗn hợp đạt pH 2.
- Tiến hành gia nhiệt hỗn hợp lên 80°C trong 10 phút hoặc ủ qua đêm rồi thu dịch lọc, bỏ bã.
- Tiếp tục cô đặc dịch lọc ở 60°C lên 10 lần rồi kết tủa pectin bằng ethanol lạnh theo tỷ lệ cồn: dịch lọc là 3:1.
- Lọc thu tủa đem sấy ở 50°C và tiến hành bảo quản pectin.
2.2.1.2Xác định chỉ số este (DE) hóa của pectin
Chỉ số DE được xác định theo phương pháp của Eloı´sa Rovaris Pinheiro và cs (2008), thực hiện như sau:
- Cân 0,2 g pectin khô - Làm ướt bằng ethanol.
- Bổ sung thêm 20 ml nước cất rồi khuấy trong 2giờở 40°C. - Bổ sung vào dịch vài giọt phenolphthalein.
- Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Lượng dung dịch NaOH đã được sử dụng: It
- Bổ sung 10 ml NaOH 0,1N rồi khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. - Sau 2 giờ, bổ sung thêm 10 ml dung dịch HCl 0,1N.
- Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Lượng dung dịch NaOH đã được sử dụng: Ft
31
Nguyễn Hồng Ly
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1 Xác định pectin bằng phương pháp canxi pectat
- Nguyên tắc: phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa.
- Cách tiến hành:
Cho 0.15g pectin nghiên cứu vào bình dung tích 100 ml, thêm nước cho tới vạch
định mức và để yên trong một số thời gian cho dung dịch đồng nhất
Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dung dịch này và thêm vào dung dịch 100 ml
NaOH 1N. Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm cho pectin bị xà phòng hóa hoàn toàn thành axit pectic. Thêm 50 ml dung dịch axit axetic 0.1N và sau 5 phút thêm 50 ml CaCl2 2N rồi để yên 1 giờ. Tiếp đó đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi. Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không con ion clo nữa (thử với dung dịch bạc nitrat 1%).
Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105°C cho tới trọng
lượng không đổi. - Tính kết quả
Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) tính theo công thức sau: B = 1 2 . V V m Trong đó:
m: Trọng lượng của pectin lấy để pha thành dịch (gam) V1: Thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml)
V2: Thể tích dung dịch pectin lấy đề xà phòng hóa (ml)
Hàm lượng của pectat canxi bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không. Hàm lượng pectin (P) được tính theo công thức sau: (%)
P =
B m.0.92.100 Ởđây:
32
Nguyễn Hồng Ly
M: Trọng lượng của kết tủa canxi pectat (gam)
B: Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (gam)
0.92: Hệ số tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (tức là pectin chiếm 92% trọng lượng của canxi pectat)
100: Hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo phần trăm %
2.2.2.2 Xác định đường khử bằng phương pháp DNS (Miller-1959)
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử
với thuốc thử acid dinitro salisilic. Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng
độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dịch
đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan suy ra hàm lượng
đường khử của dịch nghiên cứu.
- Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: pha các mẫu đường monogalacturonan có nồng độxác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1 ml thuốc thử DNS trong thời gian 10 phút. Kết quảđược đem đo mật độ quang ởbước sóng 575nm. Từđó lập ra
được đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD.
Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonan được biểu diễn trong đồ thị dưới đây:
33
Nguyễn Hồng Ly
Theo đồ thị trên, có thểtính được nồng độđường khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phương trình sau:
x = (mg/ml)
Trong đó: x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD)
2.2.2.3. Xác định hoạt độ Endo- polygalacturonase
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào hàm lượng sản phẩm tạo thành trong dung dịch phản ứng dưới tác dụng của Endo galacturonase ở những điều kiện nhất định.
Một đơn vị hoạt độ Endo galacturonase được định nghĩa là lượng enzym xúc tác giải phóng 1 µmol monogalacturonan trong 1 phút ở điều kiện đã cho (50°C, pH=4).[13]
- Tiến hành: dựa vào hàm lượng đường khử ta tính được hoạt độ của Endo- polygalacturonase với cơ chất là PGA pha trong đệm citrat pH 4 (1% w/v). Phản
ứng enzym:180 µl dung dịch acid polygalacturonic 1% w/v với 20 µl dung dịch enzym (được pha loãng tới nồng độ thích hợp), phản ứng được tiến hành ở 50°C trong 10 phút.
Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Hỗn hợp dịch sau đo được ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại cặn (nếu có)
và đo độ hấp thụởbước sóng 575 nm.
Hoạt độ Endo- polygalacturonase được xác định bằng công thức: H = (U/ml)
Trong đó: X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml) f: hệ số pha loãng
1000: hệ sốquy đổi
194: khối lượng phân tửcơ chất Monogalacturonic acid t: thời gian thủy phân (10 phút)
34
Nguyễn Hồng Ly
2.2.2.4. Định tính POS bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Nguyên tắc: chất cần phân tích cho tương tác với 2 pha: pha tĩnh và pha động. Pha
động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp thụ. Tại đây, chất cần phân tích sẽtương tác với chất hấp thụ nhờ tính có cực của chúng. Do sựtương
tác này mà chất phân tích sẽ chuyển động chậm hơn trong hệ thống sắc ký. Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách chuyển dịch lớn hơn so với chất có ái lực cao hơn. Nhờ vậy mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc ký ở các vị trí khác nhau.
- Tiến hành: sấy bản sắc ký ở nhiệt độ 70°C trong thời gian 10 phút. Lấy bản sắc
ký ra và đánh dấu các điểm chấm.
Dùng ống mao quản chấm lên bản sắc ký lớp mỏng hỗn hợp chứa các đường chuẩn (mono, di, tri) galacturonic acid (mỗi loại đường chuẩn chấm 3µl). Sau đó
chấm các dịch đường cần phân tích lên các điểm đã vạch sẵn.
Tiến hành chạy sắc ký trong hệ dung môi (butanol: axit acetic: nước tỷ lệ 9:4:7) đã bão hòa. Khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của bản sắc ký 1cm, ta lấy bản sắc ký ra và sấy khô ở 80°C rồi cho vào dung dịch thuốc hiện màu 5% H2SO4 đậm đặc trong etanol tuyệt đối. Sau đó sấy ở 120°C đến khi hiện màu. Thành phần trong dịch đường được định tính bằng cách so sánh với các đường chuẩn.
2.2.2.5. Tối ưu hóa các điều kiện tạo POS theo phương pháp quy hoạch bậc 2
Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5
- Nguyên tắc: Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân tạo POS theo phương pháp quy
hoạch bậc 2 Box-Behnken. Thiết kế Box-Behnken là cách thiết kế thí nghiệm sử
dụng phương pháp đáp ứng bề mặt nhằm các mục tiêu sau:
• Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị bằng nhau (ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho việc tối ưu hóa).
• Thiết kế tối thiểu đủ để phù hợp với một mô hình bậc 2, nghĩa là mỗi thí nghiệm có đủ điều kiện quy hoạch bậc 2 với hai yếu tố.
• Tỷ lệ sốlượng các điểm thử nghiệm với số hệ số trong mô hình bậc hai cần
35
Nguyễn Hồng Ly
• Các phương sai ước lượng ít hay nhiều phụ thuộc vào khoảng cách từ thí nghiệm tại tâm, và không nên thay đổi quá nhiều bên trong các khối lập
phương (hyper) nhỏ nhất có chứa các điểm thử nghiệm.
Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa theo hàm
mong đợi. ANOVA được sử dụng đểđánh giá các thông số thống kê.
Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y= b0 + b1X1 + b11 X1 2
+ b2 X2 + b22 X2
2
+ b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
- Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ
khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố.
Bảng 2.1. Các biến số và khoảng chạy của chúng
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1 X1 Nồng độ Enzym U/g 30 50
X2 Nhiệt độ oC 45 55
X3 Tốc độ khuấy vòng/phút 200 300 - Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó
36 Nguyễn Hồng Ly Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm TN Nhiệt độ (độ C) Nồng độ Enzym (U/g pectin) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Hàm lượng đường khử (mg/ml) 1 45 30 250 2 55 30 250 3 35 25 250 4 45 25 250 5 35 20 200 6 45 20 200 7 35 20 300 8 45 20 300 9 40 15 200 10 40 25 200 11 40 15 300 12 40 25 300 13 40 20 250 14 40 20 250 15 40 20 250 16 40 20 250 17 40 20 250
- Tiến hành thực nghiệm: Thủy phân pectin bằng endo - polygalacturonase trong cốc thủy tinh đặt trong thiết bịổn định nhiệt độ với thời gian thủy phân 4 giờ, pH = 4. Kết thúc quá trình thủy phân, dịch thủy phân được xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
- Tính toán hệ số của hàm hồi quy.
- Kiểm tra độ phù hợp của mô hình và sựcó nghĩa của các hệ số hồi quy. - Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.
37
Nguyễn Hồng Ly
Tìm cực trị của phương trình hồi quy:
Y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3