Điểm hoạt tính prebiotic (điểm prebiotic) là một khái niệm được sử dụng nhằm định lượng hiệu quả của prebiotic thuận lợi hơn. Theo Huebner và cộng sự (2007) điểm prebiotic phản ánh khả năng tăng sinh của hợp chất kiểm tra đối với một chủng vi sinh vật nhất định so với các chủng vi sinh vật khác và so với khả năng tăng sinh của chúng trên một hợp chất không phải là prebiotic như glucose. Theo đó, điểm prebiotic được các tác giả này xác định qua mức độ thay đổi sinh khối của probiotic sau 24 giờ nuôi trong môi trường có chứa 1% prebiotic hoặc 1% glucose so với mức độ thay đổi sốlượng vi khuẩn đường ruột có hại trong điều kiện nuôi cấy tương tự. Sựthay đổi sinh khối có thểxác định theo phương pháp đếm trên
môi trường thạch đĩa hoặc đo OD600.
Điểm hoạt tính của POS trên 9 chủng vi khuẩn probiotic thuộc Lactobacillus
67
Nguyễn Hồng Ly
Hình 3.23.Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng Lactobacillus
Kết quả cho thấy, chế phẩm POS khi kết hợp với L. acidophilus cho điểm prebiotic cao nhất (0,597) và thấp nhất là L. fermentum (0,525). Điều này có thể do
L. acidophilus sử dụng POS và sinh trưởng, phát triển nhanh hơn so với L. fermentum. Với MOS, điểm prebiotic cao nhất đạt được khi kết hợp với L. amylovorus, trong khi ở FOS là L. bulgaricus và Inulin là L. reuteri. Như vậy, khi tạo chế phẩm sinh học kết hợp giữa vi khuẩn có lợi và POS có thể kết hợp giữa POS với vi khuẩn L. acidophilus để tạo ra chế phẩm có hoạt tính sinh học cao hơn các cách kết hợp khác để ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy hải sản.
Ngoài ra, khi ủ POS1% (w/v) trong đệm PBS chứa α-amylase (100 U/ml) và pancreatin (0,2% w/v) trong 3 giờ nhận thấy nồng độ và thành phần POS không
thay đổi, do đó POS có thể bền trong môi trường đường tiêu hóa của người và vật nuôi.
Như vậy, POS sản xuất từ vỏ chanh leo bởi Pectinex Ultra SP-L có một số hoạt tính sinh học như: có khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi Lactobacillus và ức chế vi khuẩn gây hại (E. coli, S. typhi và S. aureus) trong điều kiện in vitro. Điểm hoạt tính prebiotic của POS đối với L. acidophiluskhá cao so với các vi khuẩn probiotics và
68
Nguyễn Hồng Ly
prebiotic khác. Do đó, có thể sử dụng POS làm thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thứcăn thủy hải sản.
69
Nguyễn Hồng Ly
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã đưa ra được một số kết luận sau:
1. Đã hoàn thiện được quy trình tách chiết pectin từ vỏ chanh leo, đạt hàm lượng pectin tinh khiết là 95%, chỉ số DE 38% đáp ứng yêu cầu nguyên liệu nghiên cứu
cho đề tài.
2. Bằng phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken đã tìm được điều kiện tối ưu
thủy phân pectin nồng độ 3% (w/v) bằng endo-polygalacturonase tạo Pectic oligosaccharide: - Nhiệt độ: 51.60C - Nồng độ enzym: 42.6 U/g - Tốc độ khuấy: 263.8 vòng/phút - pH 4.0 - Thời gian thủy phân 4 giờ
3. Bước đầu xác định một số hoạt tính sinh học quan trọng của chế phẩm POS:
- Làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi như: L. acidophilus NCFM (193.37%), L. bulgaricus CH-3 (187.27%), Lactobacillus rhamnosus GG (175.46%), L. plantarum
299V (164.5%), L. amylovorus DSM16698 (154.39%), , L. reuteri DSM 17938 (152.81%), L. casei Shirota (140.24%), , L. fermentum PCC (137.71%), , L. johnsonii La1 (137.41%)
-Làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại như: Escherichia coli 0157:H7 (68.59%),
Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC 19430 - S. typhi ATCC (87.26%)và Staphylococcus aureus ATCC 25923 (88.08%)
- Điểm hoạt tính prebiotic của POS trên các chủng Lactobacillus đã nghiên cứu cho kết quả khá cao, cao nhất là L.acidophilus đạt 0.597 và thấp nhất là L. fermentum
70
Nguyễn Hồng Ly
II. KIẾN NGHỊ
- Nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao hiệu suất quá trình thủy phân pectin tạo POS - Chứng minh hoạt tính sinh học của POS trên một số loại vi khuẩn probiotics
khác.
- Nghiên cứu thêm một số hoạt tính sinh học khác của POS: hoạt tính chống oxi hóa, khả năng ức chế tế bào ung thư...
71
Nguyễn Hồng Ly
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đặng Thị Thu (2011). Bài giảng cao học ngành công nghệ sinh học trường
đại học Bách Khoa Hà Nội, môn học Prebiotics và Probiotics.
2. MT Đensikov, Tận dụng phế liệu của công nghiệp thực phẩm, NXB học
vàKỹ thuật, 1977
TIẾNG ANH
3. A. Chaudhri,V. Suneetha (2012) Microbially derived Pectinase: A review. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2(2), pp.1-5.
4. A.M.M. Combo, M. Aguedo, N. Quiévyb, S. Danthinec, D. Goffina, N. Jacquet, C. Blecker, J. Devauxb, M. Paquot (2013) Characterization of sugar beet pectic-derived oligosaccharides obtained by enzymatic hydrolysis. International Journal of Biological Macromolecules, 52, pp. 148- 156.
5. A.P. Vos, B.C. van Esch, B. Stahl, L. M’Rabet, G. Folkerts, F.P. Nijkamp (2007) Dietary supplementation with specific oligosaccharide mixtures
decreases parameters of allergic asthma in mice. International
Immunopharmacology, 7(12), pp. 1582-1587.
6. Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo, Dorothée Goffin Bernard Wathelet, Michel Paquot (2012), Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations, Food and Bioproducts Processing, Vol 90(3), pp. 588-596. 7. Arland T., Hotchkiss Jr., Estibaliz Olano Martin, Grace W.E., Gibson G.R,
Rastall R.A. (2003), Pectic oligosaccharides and Prebiotics, ACS Symposium Series, Vol. 849, pp.54-62
8. Chen J., Liang R., Wei Liu, Li T., Liu C., Wu S., Wang Z. Pectic- oligosaccharides prepared by dynamic high-pressure microfluidization and
72
Nguyễn Hồng Ly
their in vitro fermentation properties Carbohydrate Polymers 91(1) (2013) 175-182
9. Combo A. M. M., Aguedo M., Goffin D., Wathelet B., Paquot M. - Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations. Food and bioproducts processing 90 (2012) 588–596.
10.Courtois J. (2009), Oligosaccharides from land plants and algae: production and applications in therapeutics and biotechnology. Curr. Opin. Microbiol. 12, pp.261-273.
11.De Vries, J. A.; Rombouts, F. M.; Voragen, A. G. J.; Pilnik, W. Comparison of the structural features of apple and citrus pectic substances. Carbohydr. Polym. 1984, 4, 89-101.
12.Donal J. Huber, Yasar Karakurt, Jinwon Jeong (2001), Pectin degradation in ripening and wounded fruits, R. Bras. Fisiol. Veg.13(2), pp.224-241.
13.Dongwski G., Lorenz A., Proll J., (2002), The degree of methylation influences the degradation of pectin in the intestinal tract of rats and in vitro. J. Nutr., 132, pp.1935-1944.
14.E. Olano-Martin, et al., Continuous Production of Pectic Oligosaccharides
in an Enzyme Membrane Reactor. Food Engineering and Physical
Properties., 2001. 66(7): p. pp. 966 – 971.
15.E. Olano-Martin, G.H. Rimbach, G.R. Gibson, R.A. Rastall (2003) Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in vitro human colonic adenocarcinoma cells. Anticancer Research, 23(1A), 341-346.
16.E. Olano-Martin, M.R. Williams, G.R. Gibson, R.A. Rastall (2003) Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiology Letters, 218(1), 101-105.
73
Nguyễn Hồng Ly
17.E.A.M. Westerbeek, J.P. Berg, H.N. Lafeber, W.P.F. Fetter, G. Boehm, J.W.R. Twisk, R.M. Elburg (2010) Neutral and acidic oligosaccharides in preterm infants: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial1–4. Am J Clin Nutr 91, pp. 679-686.
18.European patent. EP 0 868 854 A2 Low-molecular pectin, and food and drink which contain low-molecular pectin. Bulletin 1998/41.
19.Guillotin, Stéphanie E. Studies on the intra- and intermolecular distributions of substituents in commercial pectins Ph.D. thesis Wageningen University, The Netherlands, 2005 with summaries in Dutch and in French
ISBN 90-8504-265-8
20.Gullon B., Gomez B., Martınez-Sabajanes M., Yanez R., Parajo J.C., Alonso J.L. - Pectic oligosaccharides: Manufacture and functional properties. Trends in Food Science & Technology 30 (2013) 153-161.
21.H.A. Murad, H.H. Azzaz (2011) Microbial pectinase and ruminant nutrion. Research Journal of Microbiology, 6(3), 246-269.
22.Hotchkiss A.T., Manderson K., Olano Martin E., Grace W.E., Gibson G.R., Rastall R.A. (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications. Agricultural Research Service, http://www.ars.usda.gov
23.Ilse Fraeye, Thomas Duvetter, Isabel Verlent, Daniel Ndaka Sila, Marc Hendrickx, Ann Van Loey .Laboratory of Food Technology, Centre for Food and Microbial Technology, Department of Microbial and Molecular Systems,Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, B-3001 Leuven, BelgiumComparison of enzymatic de-esterification of strawberry and apple pectin atelevated pressure by fungal pectinmethylesterase
24.J. Concha, M.E. Zúñiga (2012) Enzymatic depolymerization of sugar beet pulp: Production and characterization of pectin and pectic-oligosaccharides
74
Nguyễn Hồng Ly
as a potential source for functional carbohydrates. Chemical Engineering Journal 192, pp. 29-36.
25.J.C. Dumville, S.C. Fry (2000), Uronic acid-containing oligosaccharins: Their biosynthesis, degradation and signalling roles in non-diseased plant tissues, Plant Physiol. Biochem., Vol 38(1/2), pp.125-140.
26.L. GOMEZ-RUIZ, M. GARCIA-GARIBAY, and E. BARZANA (1988)
Utilization of Endo-Polygalacturonase from Kluyveromyces fragilis in the Clarification of Apple Juice, Journal of Food Science, volume 53, pp. 1236-1237.
27.M.E.David, C.V.Maxwell, D.C.Brown, B.Z.de Rodaz, Z.B.Johnson, E.B.Kegley, D.H.Hellwig and R.A.Dvorak. 2002. Effect of dietary manna oligosaccharides and(or) pharmacological additions of copper salfate on growth performance and immunocompetence of weanling and growing/finishing pigs.J.Anim.Sci.2002. 80:2887-2894
28.M.M. Sabajanes, R. Yáñez, J.L. Alonso, J.C. Parajó (2012) Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis. International Journal of Food Science & Technology, 47(4), pp. 747–754.
29.Mandalari G., Nueno Palop C., Tuohy K., Gibson G.R., Bennett R.N., Waldron K.W., Bisgnano G., Narbad A., Faulds C.B. (2007), In vitro evaluation of the prebiotic activity of a POS- rich extract enzymatically derived from bergamot peel, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 73(5), pp.1173-1179
30.Mandalari G., Palop C.N., Tuohy K., Gibson G.R., Bennett R.N., Waldron K.W., Bisignano G., Narbad A., Faulds C.B. - In vitro evaluation of the prebiotic activity of a pectic oligosaccharide-rich extract enzymatically
75
Nguyễn Hồng Ly
derived from bergamot peel. Applied Microbiology and Biotechnology 73 (2007) 1173–1179
31.Manderson K., Pinart M., Tuohy K. M., Grace W. E., Hotchkiss A. T., Widmer W., YadhavM. P., Gibson G. R., Rastall R. A. (2005), In vitro determination of prebiotics properties of oligosaccharides delived from an orange juice manufacturing by - product stream. Applied and environmental microbiology, Vol 71(12), pp. 8383-8389.
32.Martina Martínez Sabajanes, Remedios Yánez, Jose L.Alonso, Juan C.Parajó.2012. Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis, International Journal of Food Science & Technology, Vol 47(4), pp.747-754
33.Olano-Martin E., G. R. Gibson and R. A. Rastall (2002), Comparison of the in vitro bifidogenic properties of pectins and pectic-oligosaccharides, J. Appl. Microbiol. Vol 93, pp. 505-511.
34.Olano-Martin E., Mountzouris K. C., Gibson G. R., Rastall R. A. - Continuous Production of Pectic Oligosaccharides in an Enzyme Membrane Reactor. Food Engineering and Physical Properties 66 (7) (2001) 966 – 971. 35.Onumpai C., Kolida S., Bonnin E., Rastall R. A. – Microbial utilization and
selectivity fractions varying structures, Applied and Environmental Microbiology (2011), doi:10.1128/AEM.00179-11.
36.Pilnik, W.; Voragen, A. G. J. Gelling agents (pectins) from plants for food industry. AdV. Plant Cell Biochem. Biotechnol. 1992, 1, 219-270.
37.Qiang X., Yonglie C., Qianbing W. (2009), Health benefit application of functional oligosaccharides, Carbohydr. Polym., 77, pp.435-441
38.Rhoades J., Manderson K., Wells A., Hotchkiss A. T., Gibson G. R., Formentin K., Beer M., Rastall R. A. – Oligosaccharide-mediated inhibition
76
Nguyễn Hồng Ly
of the adhesion of pathogenic Escherichia coli strains to human gut epithelial cells in vitro. Journal of food protection 7 (11) (2008) 2272 – 2277.
39.S. Ishii, K. Kiho, S. Sugiyama and H. Sugimoto – Low methoxyl pectin prepared by pectinesterase from Aspergillus japonicus Vol.44, No.2 (1979) Journal of Food Science – 611
40.T. Li, S. Li, L. Du, N. Wang, M. Guo, J. Zhang (2010) Effects of haw pectic oligosaccharide on lipid metabolism and oxidative stress in experimental hyperlipidemia mice induced by high-fat diet. Food Chemistry, 121(4), pp. 1010-1013.
TRANG WEB
41.Fructo oligosaccharide (FOS) and other oligosaccharides http://www.truestarhealth.com/Notes/1226001.html
42. Gibson and M. B. Roberfroid. (1995), Prebiotics, PDR health 12, pp. 1401 - 1412. (Web: http://www.nutritionreview.co.uk/Content/Features/default.asp)
43.Glem R. Gibson ,2004 .Prebiotic and their effect in the diet. Nutrition Review report (http://www.nutritionreview.co.uk/content/features/default.asp)
44.Hotchkiss A.T., Manderson K., Olano Martin E., Grace W.E., Gibson G.R., Rastall R.A. (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications. Agricultural Research Service, http://www.ars.usda.gov 45. http://goldenlab.vn/mach-ban-prebiotic-la-gi-tac-dung-cua-prebiotic/ 46. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.1988.tb13575.x/abstract 47.http://vegeplus.vn/fructose-oligosaccharide 48.http://www.answers.com/topic/oligosaccharides 49.http://www.foodnk.com/phu-gia-lam-day-lam-dac-pectin.html 50.http://www.foodnk.com/phu-gia-pectin-protopectin-enzyme-pectinase-va-ung-dung.html 51. http://www.nutritionreview.co.uk/Content/Features/default.asp
77 Nguyễn Hồng Ly PHỤ LỤC PL1. Lựa chọn nồng độcơ chất pectin Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) Nồng độ pectin (w/v) 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 1% 4.43 5.12 5.25 5.45 2% 5.87 6.45 6.68 6.82 3% 2.3 3.92 5.78 6.07 4% 2.15 3.05 3.66 4.26 5% 1.78 2.45 2.95 3.27
PL2: Ảnh hường của nồng độ enzym đến hàm lượng đường khử
Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) Nồng độ enzym (U/g) 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 20 3.06 4.89 7.43 9.65 30 4.22 7.89 10.78 13.95 40 5.05 9.76 14.8 17.65 50 5.68 10.64 11.89 12.64 60 5.98 11.47 11.6 10.57
PL3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) Nhiệt độ (°C) 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 40 5.34 9.13 12.76 15.34 50 6.91 10.58 15.69 18.13 60 4.63 7.63 8.41 9.06
78
Nguyễn Hồng Ly
PL4: Ảnh hường của pH đến hàm lượng đường khử Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) pH 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 3 3.28 5.17 6.21 8.07 4 5.78 9.42 12.73 15.63 5 3.94 6.06 8.74 10.05
PL5: Ảnh hưởngcủa tốc độ khuấy đến hàm lượng đường khử
Lượng đường khử tạo thành (mg/ml) Tốc độ khuấy (vòng/ phút) 1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 200 3.55 5.64 7.76 9.97 250 4.91 8.71 13.43 16.43 300 4.27 7.61 10.06 11.84 350 5.81 8.83 9.56 9.04
PL6: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử
Thời gian 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 180 phút 240 phút 300 phút 360 phút 390 phút 420 phút Hàm lượng đường khử (mg/ml) 5.91 7.02 8.47 9.98 11.58 13.79 15.34 18.76 18.45 17.03
79
Nguyễn Hồng Ly
PL7. Kết quả đếm khuẩn lạc của 9 chủng Lactobacillus trên các môi trường có chứa các loại prebiotic khác nhau
Prebiotic L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 Glucose 333.968 330.95 307.951 338.97 337.974 326.952 372.966 337.951 393.687 POS 585.968 510.958 613.951 517.971 473.975 595.948 494.968 555.946 540.968 MOS 443.964 596.95 438.948 512.974 400.973 434.949 455.966 391.946 399.969 FOS 417.969 356.036 369.952 361.97 390.973 462.954 480.57 366.54 543.09 Inulin 485.968 393.954 368.958 525.971 500.971 489.87 456.961 501.95 566.965
PL8. Xác định điểm hoạt tính prebiotic
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9
POS 0.574 0.552 0.597 0.550 0.535 0.581 0.525 0.562 0.530 MOS 0.526 0.579 0.539 0.548 0.506 0.526 0.511 0.502 0.480 FOS 0.516 0.490 0.509 0.488 0.502 0.537 0.520 0.491 0.531 Inulin 0.542 0.507 0.509 0.552 0.545 0.547 0.511 0.545 0.538