2.2.1 Phương pháp hóa học
2.2.1.1 Tách chiết pectin từ chanh leo bằng axit citric
- Vỏchanh leo được rửa sạch bằng nước máy, cắt nhỏ và chần bằng dung dịch axit citric 5% trong 3 phút sau đó được đem nghiền mịn.
- Bổ sung nước vào phần vỏ đã nghiền theo tỉ lệ 1kg vỏ : 3 kg nước rồi tiến hành bổ sung axit citric cho tới khi hỗn hợp đạt pH 2.
- Tiến hành gia nhiệt hỗn hợp lên 80°C trong 10 phút hoặc ủ qua đêm rồi thu dịch lọc, bỏ bã.
- Tiếp tục cô đặc dịch lọc ở 60°C lên 10 lần rồi kết tủa pectin bằng ethanol lạnh theo tỷ lệ cồn: dịch lọc là 3:1.
- Lọc thu tủa đem sấy ở 50°C và tiến hành bảo quản pectin.
2.2.1.2Xác định chỉ số este (DE) hóa của pectin
Chỉ số DE được xác định theo phương pháp của Eloı´sa Rovaris Pinheiro và cs (2008), thực hiện như sau:
- Cân 0,2 g pectin khô - Làm ướt bằng ethanol.
- Bổ sung thêm 20 ml nước cất rồi khuấy trong 2giờở 40°C. - Bổ sung vào dịch vài giọt phenolphthalein.
- Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Lượng dung dịch NaOH đã được sử dụng: It
- Bổ sung 10 ml NaOH 0,1N rồi khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. - Sau 2 giờ, bổ sung thêm 10 ml dung dịch HCl 0,1N.
- Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Lượng dung dịch NaOH đã được sử dụng: Ft
31
Nguyễn Hồng Ly
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1 Xác định pectin bằng phương pháp canxi pectat
- Nguyên tắc: phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa.
- Cách tiến hành:
Cho 0.15g pectin nghiên cứu vào bình dung tích 100 ml, thêm nước cho tới vạch
định mức và để yên trong một số thời gian cho dung dịch đồng nhất
Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dung dịch này và thêm vào dung dịch 100 ml
NaOH 1N. Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm cho pectin bị xà phòng hóa hoàn toàn thành axit pectic. Thêm 50 ml dung dịch axit axetic 0.1N và sau 5 phút thêm 50 ml CaCl2 2N rồi để yên 1 giờ. Tiếp đó đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi. Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không con ion clo nữa (thử với dung dịch bạc nitrat 1%).
Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105°C cho tới trọng
lượng không đổi. - Tính kết quả
Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) tính theo công thức sau: B = 1 2 . V V m Trong đó:
m: Trọng lượng của pectin lấy để pha thành dịch (gam) V1: Thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml)
V2: Thể tích dung dịch pectin lấy đề xà phòng hóa (ml)
Hàm lượng của pectat canxi bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không. Hàm lượng pectin (P) được tính theo công thức sau: (%)
P =
B m.0.92.100 Ởđây:
32
Nguyễn Hồng Ly
M: Trọng lượng của kết tủa canxi pectat (gam)
B: Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (gam)
0.92: Hệ số tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (tức là pectin chiếm 92% trọng lượng của canxi pectat)
100: Hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo phần trăm %
2.2.2.2 Xác định đường khử bằng phương pháp DNS (Miller-1959)
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử
với thuốc thử acid dinitro salisilic. Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng
độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dịch
đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan suy ra hàm lượng
đường khử của dịch nghiên cứu.
- Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: pha các mẫu đường monogalacturonan có nồng độxác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1 ml thuốc thử DNS trong thời gian 10 phút. Kết quảđược đem đo mật độ quang ởbước sóng 575nm. Từđó lập ra
được đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD.
Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonan được biểu diễn trong đồ thị dưới đây:
33
Nguyễn Hồng Ly
Theo đồ thị trên, có thểtính được nồng độđường khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phương trình sau:
x = (mg/ml)
Trong đó: x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD)
2.2.2.3. Xác định hoạt độ Endo- polygalacturonase
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa vào hàm lượng sản phẩm tạo thành trong dung dịch phản ứng dưới tác dụng của Endo galacturonase ở những điều kiện nhất định.
Một đơn vị hoạt độ Endo galacturonase được định nghĩa là lượng enzym xúc tác giải phóng 1 µmol monogalacturonan trong 1 phút ở điều kiện đã cho (50°C, pH=4).[13]
- Tiến hành: dựa vào hàm lượng đường khử ta tính được hoạt độ của Endo- polygalacturonase với cơ chất là PGA pha trong đệm citrat pH 4 (1% w/v). Phản
ứng enzym:180 µl dung dịch acid polygalacturonic 1% w/v với 20 µl dung dịch enzym (được pha loãng tới nồng độ thích hợp), phản ứng được tiến hành ở 50°C trong 10 phút.
Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Hỗn hợp dịch sau đo được ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại cặn (nếu có)
và đo độ hấp thụởbước sóng 575 nm.
Hoạt độ Endo- polygalacturonase được xác định bằng công thức: H = (U/ml)
Trong đó: X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml) f: hệ số pha loãng
1000: hệ sốquy đổi
194: khối lượng phân tửcơ chất Monogalacturonic acid t: thời gian thủy phân (10 phút)
34
Nguyễn Hồng Ly
2.2.2.4. Định tính POS bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Nguyên tắc: chất cần phân tích cho tương tác với 2 pha: pha tĩnh và pha động. Pha
động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp thụ. Tại đây, chất cần phân tích sẽtương tác với chất hấp thụ nhờ tính có cực của chúng. Do sựtương
tác này mà chất phân tích sẽ chuyển động chậm hơn trong hệ thống sắc ký. Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách chuyển dịch lớn hơn so với chất có ái lực cao hơn. Nhờ vậy mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc ký ở các vị trí khác nhau.
- Tiến hành: sấy bản sắc ký ở nhiệt độ 70°C trong thời gian 10 phút. Lấy bản sắc
ký ra và đánh dấu các điểm chấm.
Dùng ống mao quản chấm lên bản sắc ký lớp mỏng hỗn hợp chứa các đường chuẩn (mono, di, tri) galacturonic acid (mỗi loại đường chuẩn chấm 3µl). Sau đó
chấm các dịch đường cần phân tích lên các điểm đã vạch sẵn.
Tiến hành chạy sắc ký trong hệ dung môi (butanol: axit acetic: nước tỷ lệ 9:4:7) đã bão hòa. Khi vệt chạy của dung môi cách mép trên của bản sắc ký 1cm, ta lấy bản sắc ký ra và sấy khô ở 80°C rồi cho vào dung dịch thuốc hiện màu 5% H2SO4 đậm đặc trong etanol tuyệt đối. Sau đó sấy ở 120°C đến khi hiện màu. Thành phần trong dịch đường được định tính bằng cách so sánh với các đường chuẩn.
2.2.2.5. Tối ưu hóa các điều kiện tạo POS theo phương pháp quy hoạch bậc 2
Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5
- Nguyên tắc: Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân tạo POS theo phương pháp quy
hoạch bậc 2 Box-Behnken. Thiết kế Box-Behnken là cách thiết kế thí nghiệm sử
dụng phương pháp đáp ứng bề mặt nhằm các mục tiêu sau:
• Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị bằng nhau (ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho việc tối ưu hóa).
• Thiết kế tối thiểu đủ để phù hợp với một mô hình bậc 2, nghĩa là mỗi thí nghiệm có đủ điều kiện quy hoạch bậc 2 với hai yếu tố.
• Tỷ lệ sốlượng các điểm thử nghiệm với số hệ số trong mô hình bậc hai cần
35
Nguyễn Hồng Ly
• Các phương sai ước lượng ít hay nhiều phụ thuộc vào khoảng cách từ thí nghiệm tại tâm, và không nên thay đổi quá nhiều bên trong các khối lập
phương (hyper) nhỏ nhất có chứa các điểm thử nghiệm.
Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa theo hàm
mong đợi. ANOVA được sử dụng đểđánh giá các thông số thống kê.
Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y= b0 + b1X1 + b11 X1 2
+ b2 X2 + b22 X2
2
+ b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
- Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ
khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố.
Bảng 2.1. Các biến số và khoảng chạy của chúng
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1 X1 Nồng độ Enzym U/g 30 50
X2 Nhiệt độ oC 45 55
X3 Tốc độ khuấy vòng/phút 200 300 - Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó
36 Nguyễn Hồng Ly Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm TN Nhiệt độ (độ C) Nồng độ Enzym (U/g pectin) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Hàm lượng đường khử (mg/ml) 1 45 30 250 2 55 30 250 3 35 25 250 4 45 25 250 5 35 20 200 6 45 20 200 7 35 20 300 8 45 20 300 9 40 15 200 10 40 25 200 11 40 15 300 12 40 25 300 13 40 20 250 14 40 20 250 15 40 20 250 16 40 20 250 17 40 20 250
- Tiến hành thực nghiệm: Thủy phân pectin bằng endo - polygalacturonase trong cốc thủy tinh đặt trong thiết bịổn định nhiệt độ với thời gian thủy phân 4 giờ, pH = 4. Kết thúc quá trình thủy phân, dịch thủy phân được xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
- Tính toán hệ số của hàm hồi quy.
- Kiểm tra độ phù hợp của mô hình và sựcó nghĩa của các hệ số hồi quy. - Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.
37
Nguyễn Hồng Ly
Tìm cực trị của phương trình hồi quy:
Y= b0 + b1X1 + b11 X12+ b2 X2 + b22 X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả đạt giá trị cưc trị tại X1, X2, X3tương ứng với giá trị nồng độ enzym, nhiệt độ và tốc độ khuấy.
Vậy hiệu suất thu hồi PG đạt giá trị lớn nhất tại tại X1, X2, X3 tương ứng với giá trị nồng độ enzym, nhiệt độ và tốc độ khuấy tương ứng.
2.2.3. Phương pháp vi sinh
2.2.3.1. Xác định hoạt tính prebiotic của POS invitro
Xác định hoạt tính prebiotic của POS theo phương pháp Huebner J. và cộng sự
(2007).
- Nguyên tắc: Hoạt tính prebiotic của một chất phản ánh khả năng hỗ trợ sự
phát triển của một vi sinh vật nhất định so với các vi sinh vật khác và so với khả năng phát triển trên môi trường không có hoạt tính prebiotic như glucose. Do đó,
cacbonhydrate có hoạt tính prebiotic nếu nó được chuyển hóa tương tựnhư glucose
bởi các chủng probiotic và được chọn lọc chuyển hóa bởi các chủng probiotic thay vì bởi các vi sinh vật đường ruột khác.
- Tiến hành: Cấy 1% (v/v) canh trường chứa các chủng probiotic đã được để qua đêm vào các ống nghiệm riêng biệt có chứa môi trường MRS Broth với 1% (w/v) glucose hoặc 1% (w/v) prebiotics. Các ống được nuôi ở 370C trong tủ nuôi
ấm. Sau đó, cấy trang các mẫu canh trường chứa vi sinh vật đó ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ trên môi trường MRS rắn. Các mẫu chứa vi khuẩn đường ruột được tiến hành tương tự và song song với thí nghiệm trên.
Chỉ số hoạt tính prebiotic được tính theo công thức sau: Chỉ số hoạt tính prebiotic = -
Trong đó:
Pp = Log (số lượng khuẩn lạc/ml của Lactobacillus tăng sinh sau 24 giờ trên
môi trường chứa POS), Pg = Log (số lượng khuẩn lạc/ml của Lactobacillus tăng
38
Nguyễn Hồng Ly
của E. coli tăng sinh sau 24 giờ trên môi trường chứa POS), Eg = Log (số lượng khuẩn lạc/ml của E. coli tăng sinh sau 24 giờ trên môi trường chứa glucose) [26].
2.2.3.2 Xác định Lactobacillus
TCVN 5522:1991. Sản phẩm thực phẩm. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn chủng Lactobacillus.
2.2.3.3 Xác định Salmonella
TCVN 4829:2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp
phát hiện Salmonellatrên đĩa thạch.
2.2.3.4 Xác định E.coli
TCNV 6505:2005 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp
phát hiện E.coli trên đĩa thạch.
2.2.3.5 Xác định Staphylococcus
TCVN 7029:2009 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp
39
Nguyễn Hồng Ly
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Hoàn thiện quy trình tách chiết pectin từ chanh dây
Hiện nay, nhiều cơ sở sản xuất, chế biến chanh dây cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước những sản phẩm như nước chanh dây cô đặc, pure lạc tiên hoặc
nước lạc tiên,... Nguồn vỏ quả thải ra từ quá trình chế biến này là rất lớn và khá tập
trung đảm bảo cho việc tận thu pectin từ nguồn phụ phẩm này. Vì vậy, đề tài lựa chọn pectin chanh dây làm nguồn cơ chất cho quá trình nghiên cứu các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS.
Chúng tôi tiến hành quy trình tách chiết pectin từ vỏ quả chanh dây bằng acid citric theo sơ đồở hình 3.1. Quy trình cụ thểnhư sau:
Bước 1: Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu sau khi thu hồi được rửa sạch dưới nước máy rồi tiến hành cắt nhỏ với kích thước từ 1cm2 – 2cm2. Sau đó, chần trong dung dịch axit citric 3% ở
100oC trong 5 phút nhằm loại bỏ một số chất dễoxi hóa, đường, các chất màu trong vỏ chanh và bất hoạt các enzym oxi hóa.
Vỏ chanh sau khi chần được tiến hành nghiền mịn và bổsung nước cất theo tỉ lệ 1 kg nguyên liệu : 3 kg nước sau đó được chuyển qua giai đoạn thủy phân tạo pectin.
Bước 2: Chiết pectin bằng acid citric
Pectin được hòa tan tốt trong môi trường acid, vì vậy tiến hành bổ sung acid
citric cho đến khi đạt pH 2.0, gia nhiệt đến 80°C trong 10 phút..
Bước 3: Thu nhận dịch và cô đặc
Hỗn hợp dịch sau chiết bằng acid citric được lọc bõ bã, thu dịch pectin thô (2,5oBx) rồi tiến hành cô đặc 10 lần (25oBx) bằng phương pháp cô quay chân không ở 60°C.
Bước 4: Làm sạch pectin bằng phương pháp kết tủa
Dịch pectin thô sau khi được cô đặc sẽ tiến hành kết tủa bằng ethanol 75% ở
4°C trong 2 giờđể thu pectin tinh khiết hơn.
40
Nguyễn Hồng Ly
Kết tủa pectin được sấy trong tủ sấy ở 60°C, thu chế phẩm dạng bột và tiến
hành xác định thành phần hóa học của chế phẩm.
Hình 3.1 Quy trình tách chiết pectin từ chanh dây Xử lí nguyên liệu Chiết pectin bằng acid citric Thu dịch, Cô đặc Kết tủa Sấy PECTIN (95%) Vỏ chanh dây
41
Nguyễn Hồng Ly
Tiến hành xác định thành phần hóa học của pectin, kết quả biểu diễn trong bảng sau:
Bảng 3.1 Thành phần của pectin tách chiết từ chanh dây
Thành phần hóa học Hàm lượng Pectin(%) 95 DE pectin (%) 70 (Chanh tím) - HMP 38 (Chanh vàng) - LMP Độẩm (%) 5,47 Hàm lượng tinh bột (%) 0,5 Hàm lượng protein (%) 0 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) 6×10 Coliform (MPN/g) 10 S.aureus (CFU/g) 0
Như vậy, hàm lượng pectin thu được theo phương pháp tách chiết bằng axit citric rất cao, đạt tới 95%, mức độ este hóa (DE) của pectin tách chiết từ vỏ chanh dây tím là 70% (HMP) và của pectin tách chiết từ chanh dây vàng là 38% (LMP). Kết quả chất lượng pectin tách chiết từ chanh dây vàng đáp ứng yêu cầu nghiên cứu