Nghiên cứu khả năng tăng sinh của các chủng probiotic Lactobacillus như
L.rhamnosus (L1), L.amylovorus (L2), L.acidophilus (L3) L.reuteri (L4), L.casei (L5), L. bulgaricus (L6), L.fermentum (L7), L. plantarum(L8), L.johnsonii (L9), trên
môi trường chứa POS. Kết quả từ bảng 3.5:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi Chủng
thử
nghiệm
Sốlượng khuẩn lạc tăng sau 24 giờ nuôi (x107cfu/ml) Tỷ lệtăng sinh so với glucose (%) Môi trường (MR + Glucose) Môi trường (MR + POS) L1 333,97 ± 6,03 585,97 ± 15,00 175,46 L2 330,95 ± 10,05 510,96 ± 10,03 154,39 L3 307,95 ± 12,00 613,95 ± 6,05 199,39 L4 338,97 ± 13,03 517,97 ± 7,03 152,81 L5 337,97 ± 6,03 473,98 ± 8,98 140,24 L6 326,95 ± 8,05 595,95 ± 14,05 182,27 L7 372,97 ± 12,03 494,97 ± 12,00 132,71 L8 337,95 ± 10,05 555,95 ± 10,05 164,5 L9 393,69 ± 4,69 540,97 ± 12,03 137,41
Kết quả cho thấy tất cả các chủng thử nghiệm đều tăng sinh mạnh trên môi trường chứa POS so với môi trường có glucose. Như vậy, các chủng Lactobacillus
này đều có khả năng sử dụng tốt pectic oligosaccharide từ vỏ chanh leo để sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên, L. acidophilus có khả năng tăng sinh mạnh nhất (199,39%) trên môi trường chứa POS từ vỏ chanh leo. Trong khi đó Mandalari G và cs (2007) cho rằng L. casei tăng sinh rất mạnh còn L. rhamnosus tăng sinh yếu
61
Nguyễn Hồng Ly
trong môi trường có oligosaccharide từ vỏ cam. Như vậy, nguồn gốc của POS có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của chủng loại vi khuẩn có lợi.
Hình 3. 17 Một số chủng Lactobacillus nuôi lần lượt trên môi trường bổ sung các prebiotic theo thứ tự glucose (1), POS (2), MOS (3), FOS (4), Inulin (5)
A1 – A5: L. rhamnosus nuôi sau 24 giờ B1 – B5: L. Acidophilus nuôi sau 24 giờ C1 – C5: L. Bulgaricus nuôi sau 24 giờ
D1 – D5: L. Plantarum nuôi sau 24 giờ E1 – E5: L.johnsonii nuôi sau 24 giờ
A1 A2 A3 A4 A5
B1 B2 B3 B4 B5
C1 C2 C3 C4 C5
D1 D2 D3 D4 D5
62
Nguyễn Hồng Ly
Để so sánh khả năng sử dụng POS của một số vi khuẩn có lợi với các loại chế phẩm prebiotic khác đang lưu hành trên thị trường Việt Nam chúng tôi tiến hành nuôi cấy 9 chủng Lactobacillus trên với thời gian 24 giờ trong môi trường MR
có chứa POS và các loại prebiotic khác: MOStm từ konjac (Trung Quốc), FOS
(Orafti P95- Bỉ), Inulin (Merck – Đức). Sau đó, xác định tỷ lệ tăng sinh sau 24 giờ so với môi trường MRS thu được kếtquả biểu diễn ở biểu đồ thị 3.17.
Hình 3.18. Khả năng tăng sinh của các chủng Lactobacillusthử nghiệm trong môi trường chứa các loại prebiotic khác nhau
Kết quả thu được cho thấy, cả 9 chủng vi khuẩn Lactobacillusđều sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường chứa POS, MOS, FOS và Inulin. Tuy nhiên, sự phát triển của mỗi chủng trên từng loại môi trường có bổ sung các chế phẩm prebiotic khác nhau đều khác nhau. Trong 9 chủng đã chọn, thấy rằng, chủng L. acidophilus, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L.fermentum và L. plantarum phát triển tốt nhất trên môi trường chứa POS, trong khi đó L. amylovorus sử dụng MOS tốt nhất còn L. reuteri, L. casei và L. johnsoniisử dụng Inulin tốt nhất. Điều này có thể do các loại vi khuẩn khác nhau có khả năng sử dụng các loại prebiotic khác nhau làm nguồn cacbon.
Như vậy, POS có thể được sử dụng làm nguồn cacbon khá tốt cho sự phát triển của vi khuẩn có lợi Lactobacillus.
63
Nguyễn Hồng Ly
3.4.2. Khả năng làm giảm số lượng vi khuẩn có hại của POS
Khi nuôi cấy các loại vi khuẩn có hại: E. coli, S. typhi và S. aureus trong môi
trường chứa POS, số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy đều giảm hơn khi nuôi các loại vi khuẩn trên trong môi trường MR - không chứa POS (bảng 3.6). Bên cạnh đó, các báo cáo cũng chỉ ra POS có khả năng làm giảm số lượng vi khuẩn Clostridia
và Bacteroides [8, 29, 32].
Bảng 3.6. Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn có hại (107cfu/ml) sau 24 giờ nuôi trên môi trường MR và bổ sung POS
Chủng vi khuẩn MR POS Tỷ lệ giảm so với MRS (%) E. coli 365,39 ± 8,61 21,88 ± 0,05 94,18 S. typhi 341,05 ± 11,05 25,31 ± 0,04 92,58 S. aureus 359,95 ± 7,95 42,47 ± 0,09 88,20
Kết quả thu được có thể giải thích do vi khuẩn E. coli, S. typhil và S. aureus
không thể sử dụng POS hay các loại vi khuẩn này không sinh enzym phân cắt POS thành các đường đơn giản sử dụng để sinh trưởng, phát triển. Bên cạnh đó, các báo
cáo cũng chỉ ra POS có khả năng làm giảm số lượng vi khuẩn Clostridia và
Bacteroides.
Nhằm so sánh khảnăng làm giảm sốlượng vi khuẩn gây hại của POS so với một số loại prebiotic khác, đề tài nuôi cấy E. coli, S. typhil và S. aureus trong môi
trường bổ sung MOS, FOS, Inulin (1% w/v). Kết quả thu được biểu diễn ở hình 3.24.
64
Nguyễn Hồng Ly
Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gây hại của các prebiotic khác nhau.
Hình 3.20 E.coli sau 24h nuôi lần lượt trên glucose, POS, MOS, FOS, Inulin
65
Nguyễn Hồng Ly
Hình 3.22 S.typhil sau 24h nuôi lần lượt trên glucose, POS, MOS, FOS, Inulin Kết quả hình 3.18 cho thấy chế phẩm BioMOS và POS có khả năng ức chế
mạnh cả 3 chủng vi khuẩn gây hại. FOS và Inulin có khả năng ức chế S. aureus
mạnh hơn 2 chủng E. coli và S. typhil.
Thực tế hệ vi sinh vật đường ruột luôn bao gồm cả loại có hại, có lợi và chúng có sựtác động qua lại với nhau. Với mục tiêu nghiên cứu ứng dụng POS làm thực phẩm bổ sung và vì hệ vi sinh vật trong đường ruột bao gồm cả loại có hại, có lợi.
Do đó, nghiên cứu tác động của POS tới cả 2 loại trên bằng cách đồng nuôi cấy cả 2 loại có lợi và có hại trong cùng môi trường có glucose hoặc POS.
Tiến hành cấy 1% (v/v) canh trường chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn bao gồm: L. acidophilus, E. coli, S. typhi và S. aureus vào các ống nghiệm chứa môi
trường MRS hoặc bổ sung 1% (w/v) POS. Các ống được nuôi ở 370C trong tủấm.
Sau đó, cấy trang các mẫu canh trường chứa vi sinh vật đó ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ trên môi trường TGA đĩa thạch để xác định số lượng vi khuẩn tổng số; cấy trang trên môi trường đặc hiệu VRBL, BSA, HSAB, MRS để xác định sốlượng vi khuẩn E. coli, S. typhi, S. aureus và L. acidophilus.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển đồng thời của vi khuẩn có lợi và có hại
Chủng thử nghiệm (tỉ lệ 1:1)
Sốlượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi (x107 cfu/ml)
Vi khuẩn tổng số L1 Vi khuẩn có hại
L1 + S. enterica Typhi 672,75 ± 7,50 658,25 ± 7,25 14,50 ± 0,01
L1+ E. coli0157:H7 616,00 ± 5,85 605,00 ± 6,10 11,00 ± 0,02
L1+ S. aureus ATCC
66
Nguyễn Hồng Ly
Kết quả thử nghiệm về ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của hai loại vi khuẩn có lợi và có hại khi chúng được nuôi kết hợp trong cùng một môi trường ở bảng 3 cho thấy mật độ vi khuẩn tổng số cũng được cải thiện khi có mặt của POS so với khi chỉ có glucose, tuy nhiên lượng tăng chủ yếu là của L. acidophilus còn vi
khuẩn có hại sinh trưởng chậm. Báo cáo của Chen (2013) chứng minh rằng
Lactobacillus và Bifidobacteriumtạo ra 31,64mM acid acetic, 12,57mM acid lactic, 7,89mM acid propionic và 7,75mM acid butyric khi nuôi cấy 24 giờ trong môi trường bổ sung POS. Đây có thể là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng làm giảm pH môi trường, ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn gây hại. Một giả thuyết nữa cho việc gây giảm số lượng vi khuẩn gây hại khi cùng nuôi cấy với L. acidophilus là do
chúng sinh ra bacteriocin làm ức chế sự phát triển của các loại vi khuẩn gây hại.
3.4.3 Điểm hoạt tính prebiotic
Điểm hoạt tính prebiotic (điểm prebiotic) là một khái niệm được sử dụng nhằm định lượng hiệu quả của prebiotic thuận lợi hơn. Theo Huebner và cộng sự (2007) điểm prebiotic phản ánh khả năng tăng sinh của hợp chất kiểm tra đối với một chủng vi sinh vật nhất định so với các chủng vi sinh vật khác và so với khả năng tăng sinh của chúng trên một hợp chất không phải là prebiotic như glucose. Theo đó, điểm prebiotic được các tác giả này xác định qua mức độ thay đổi sinh khối của probiotic sau 24 giờ nuôi trong môi trường có chứa 1% prebiotic hoặc 1% glucose so với mức độ thay đổi sốlượng vi khuẩn đường ruột có hại trong điều kiện nuôi cấy tương tự. Sựthay đổi sinh khối có thểxác định theo phương pháp đếm trên
môi trường thạch đĩa hoặc đo OD600.
Điểm hoạt tính của POS trên 9 chủng vi khuẩn probiotic thuộc Lactobacillus
67
Nguyễn Hồng Ly
Hình 3.23.Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng Lactobacillus
Kết quả cho thấy, chế phẩm POS khi kết hợp với L. acidophilus cho điểm prebiotic cao nhất (0,597) và thấp nhất là L. fermentum (0,525). Điều này có thể do
L. acidophilus sử dụng POS và sinh trưởng, phát triển nhanh hơn so với L. fermentum. Với MOS, điểm prebiotic cao nhất đạt được khi kết hợp với L. amylovorus, trong khi ở FOS là L. bulgaricus và Inulin là L. reuteri. Như vậy, khi tạo chế phẩm sinh học kết hợp giữa vi khuẩn có lợi và POS có thể kết hợp giữa POS với vi khuẩn L. acidophilus để tạo ra chế phẩm có hoạt tính sinh học cao hơn các cách kết hợp khác để ứng dụng trong thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy hải sản.
Ngoài ra, khi ủ POS1% (w/v) trong đệm PBS chứa α-amylase (100 U/ml) và pancreatin (0,2% w/v) trong 3 giờ nhận thấy nồng độ và thành phần POS không
thay đổi, do đó POS có thể bền trong môi trường đường tiêu hóa của người và vật nuôi.
Như vậy, POS sản xuất từ vỏ chanh leo bởi Pectinex Ultra SP-L có một số hoạt tính sinh học như: có khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi Lactobacillus và ức chế vi khuẩn gây hại (E. coli, S. typhi và S. aureus) trong điều kiện in vitro. Điểm hoạt tính prebiotic của POS đối với L. acidophiluskhá cao so với các vi khuẩn probiotics và
68
Nguyễn Hồng Ly
prebiotic khác. Do đó, có thể sử dụng POS làm thực phẩm chức năng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thứcăn thủy hải sản.
69
Nguyễn Hồng Ly
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã đưa ra được một số kết luận sau:
1. Đã hoàn thiện được quy trình tách chiết pectin từ vỏ chanh leo, đạt hàm lượng pectin tinh khiết là 95%, chỉ số DE 38% đáp ứng yêu cầu nguyên liệu nghiên cứu
cho đề tài.
2. Bằng phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken đã tìm được điều kiện tối ưu
thủy phân pectin nồng độ 3% (w/v) bằng endo-polygalacturonase tạo Pectic oligosaccharide: - Nhiệt độ: 51.60C - Nồng độ enzym: 42.6 U/g - Tốc độ khuấy: 263.8 vòng/phút - pH 4.0 - Thời gian thủy phân 4 giờ
3. Bước đầu xác định một số hoạt tính sinh học quan trọng của chế phẩm POS:
- Làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi như: L. acidophilus NCFM (193.37%), L. bulgaricus CH-3 (187.27%), Lactobacillus rhamnosus GG (175.46%), L. plantarum
299V (164.5%), L. amylovorus DSM16698 (154.39%), , L. reuteri DSM 17938 (152.81%), L. casei Shirota (140.24%), , L. fermentum PCC (137.71%), , L. johnsonii La1 (137.41%)
-Làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại như: Escherichia coli 0157:H7 (68.59%),
Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC 19430 - S. typhi ATCC (87.26%)và Staphylococcus aureus ATCC 25923 (88.08%)
- Điểm hoạt tính prebiotic của POS trên các chủng Lactobacillus đã nghiên cứu cho kết quả khá cao, cao nhất là L.acidophilus đạt 0.597 và thấp nhất là L. fermentum
70
Nguyễn Hồng Ly
II. KIẾN NGHỊ
- Nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao hiệu suất quá trình thủy phân pectin tạo POS - Chứng minh hoạt tính sinh học của POS trên một số loại vi khuẩn probiotics
khác.
- Nghiên cứu thêm một số hoạt tính sinh học khác của POS: hoạt tính chống oxi hóa, khả năng ức chế tế bào ung thư...
71
Nguyễn Hồng Ly
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đặng Thị Thu (2011). Bài giảng cao học ngành công nghệ sinh học trường
đại học Bách Khoa Hà Nội, môn học Prebiotics và Probiotics.
2. MT Đensikov, Tận dụng phế liệu của công nghiệp thực phẩm, NXB học
vàKỹ thuật, 1977
TIẾNG ANH
3. A. Chaudhri,V. Suneetha (2012) Microbially derived Pectinase: A review. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 2(2), pp.1-5.
4. A.M.M. Combo, M. Aguedo, N. Quiévyb, S. Danthinec, D. Goffina, N. Jacquet, C. Blecker, J. Devauxb, M. Paquot (2013) Characterization of sugar beet pectic-derived oligosaccharides obtained by enzymatic hydrolysis. International Journal of Biological Macromolecules, 52, pp. 148- 156.
5. A.P. Vos, B.C. van Esch, B. Stahl, L. M’Rabet, G. Folkerts, F.P. Nijkamp (2007) Dietary supplementation with specific oligosaccharide mixtures
decreases parameters of allergic asthma in mice. International
Immunopharmacology, 7(12), pp. 1582-1587.
6. Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo, Dorothée Goffin Bernard Wathelet, Michel Paquot (2012), Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations, Food and Bioproducts Processing, Vol 90(3), pp. 588-596. 7. Arland T., Hotchkiss Jr., Estibaliz Olano Martin, Grace W.E., Gibson G.R,
Rastall R.A. (2003), Pectic oligosaccharides and Prebiotics, ACS Symposium Series, Vol. 849, pp.54-62
8. Chen J., Liang R., Wei Liu, Li T., Liu C., Wu S., Wang Z. Pectic- oligosaccharides prepared by dynamic high-pressure microfluidization and
72
Nguyễn Hồng Ly
their in vitro fermentation properties Carbohydrate Polymers 91(1) (2013) 175-182
9. Combo A. M. M., Aguedo M., Goffin D., Wathelet B., Paquot M. - Enzymatic production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with commercial pectinase preparations. Food and bioproducts processing 90 (2012) 588–596.
10.Courtois J. (2009), Oligosaccharides from land plants and algae: production and applications in therapeutics and biotechnology. Curr. Opin. Microbiol. 12, pp.261-273.
11.De Vries, J. A.; Rombouts, F. M.; Voragen, A. G. J.; Pilnik, W. Comparison of the structural features of apple and citrus pectic substances. Carbohydr. Polym. 1984, 4, 89-101.
12.Donal J. Huber, Yasar Karakurt, Jinwon Jeong (2001), Pectin degradation in ripening and wounded fruits, R. Bras. Fisiol. Veg.13(2), pp.224-241.
13.Dongwski G., Lorenz A., Proll J., (2002), The degree of methylation influences the degradation of pectin in the intestinal tract of rats and in vitro. J. Nutr., 132, pp.1935-1944.
14.E. Olano-Martin, et al., Continuous Production of Pectic Oligosaccharides
in an Enzyme Membrane Reactor. Food Engineering and Physical
Properties., 2001. 66(7): p. pp. 966 – 971.
15.E. Olano-Martin, G.H. Rimbach, G.R. Gibson, R.A. Rastall (2003) Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in vitro human colonic adenocarcinoma cells. Anticancer Research, 23(1A), 341-346.
16.E. Olano-Martin, M.R. Williams, G.R. Gibson, R.A. Rastall (2003) Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiology Letters, 218(1), 101-105.
73
Nguyễn Hồng Ly
17.E.A.M. Westerbeek, J.P. Berg, H.N. Lafeber, W.P.F. Fetter, G. Boehm, J.W.R. Twisk, R.M. Elburg (2010) Neutral and acidic oligosaccharides in preterm infants: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial1–4. Am J Clin Nutr 91, pp. 679-686.
18.European patent. EP 0 868 854 A2 Low-molecular pectin, and food and drink which contain low-molecular pectin. Bulletin 1998/41.
19.Guillotin, Stéphanie E. Studies on the intra- and intermolecular distributions of substituents in commercial pectins Ph.D. thesis Wageningen University, The Netherlands, 2005 with summaries in Dutch and in French
ISBN 90-8504-265-8
20.Gullon B., Gomez B., Martınez-Sabajanes M., Yanez R., Parajo J.C., Alonso J.L. - Pectic oligosaccharides: Manufacture and functional properties. Trends in Food Science & Technology 30 (2013) 153-161.
21.H.A. Murad, H.H. Azzaz (2011) Microbial pectinase and ruminant nutrion. Research Journal of Microbiology, 6(3), 246-269.
22.Hotchkiss A.T., Manderson K., Olano Martin E., Grace W.E., Gibson G.R., Rastall R.A. (2004), Orange peel pectic oligosaccharide prebiotics with food and feed applications. Agricultural Research Service, http://www.ars.usda.gov
23.Ilse Fraeye, Thomas Duvetter, Isabel Verlent, Daniel Ndaka Sila, Marc Hendrickx, Ann Van Loey .Laboratory of Food Technology, Centre for Food and Microbial Technology, Department of Microbial and Molecular Systems,Katholieke Universiteit Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, B-3001 Leuven, BelgiumComparison of enzymatic de-esterification of strawberry and apple pectin atelevated pressure by fungal pectinmethylesterase
24.J. Concha, M.E. Zúñiga (2012) Enzymatic depolymerization of sugar beet pulp: Production and characterization of pectin and pectic-oligosaccharides
74
Nguyễn Hồng Ly
as a potential source for functional carbohydrates. Chemical Engineering Journal 192, pp. 29-36.
25.J.C. Dumville, S.C. Fry (2000), Uronic acid-containing oligosaccharins: Their biosynthesis, degradation and signalling roles in non-diseased plant tissues, Plant Physiol. Biochem., Vol 38(1/2), pp.125-140.
26.L. GOMEZ-RUIZ, M. GARCIA-GARIBAY, and E. BARZANA (1988)
Utilization of Endo-Polygalacturonase from Kluyveromyces fragilis in