2.1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1.1. Vật liệu
Chủng Saccharomyces cerevisiae 1 là kết quả tuyển chọn từ giai đoạn
trước, Lactobacillus acidophillus (VN1); Bacillus subtilis đó được phõn lập và định tờn tại Liờn hiệp khoa học sản xuất Cụng nghệ sinh học và mụi trường - Viện Cụng nghệ sinh học
Men bia mua từ cỏc nhà mỏy bia. Cao nấm men, pepton, đường kớnh, Glucoza, dietyl ete, NaOH, H2SO4 và cỏc húa chất phõn tớch cần thiết đảm bảo độ tinh sạch và đỏp ứng yờu cầu của cỏc thớ nghiệm.
Hệ thống lờn men, box cấy vụ trựng, mỏy đo OD, tủ ấm, mỏy lắc, mỏy ly tõm, nồi khử trựng, cõn điện tử và những mỏy múc cần khỏc.
Mụi trường nuụi cấy:
• Mụi trường YPD (g/l): Cao men 20; Pepton 40; Glucose 40;
• Mụi trường Hansen (g/l): Saccaroza 50; Pepton 5; cao men 2; K2HPO4 3; MgSO4 3;
• Mụi trường MRS (g/l): pepton 10; cao men 4; glucose 20; tween 80 1 ml; K2HPO4 2; CH3COONa.3H2O 5; NH4NO3 2; MgSO4.7H2O 0,2; MnSO4 0,05;
• Mụi trường MPA (g/l): pepton 10; cao men 5; NaCl 5; pH 7.
Khi chuẩn bị lượng lớn mụi trường, dựng 40ml NaOH 1N cho 20 lớt mụi trường MPA để chỉnh pH.
23
2.1.2. Phương phỏp nghiờn cứu
Phương phỏp bảo quản giống: Cỏc chủng nấm men nghiờn cứu được giữ trong cỏc ống mụi trường Hansen thạch ngiờng, ở 40C. Cấy chuyển thực hiện trờn cỏc ống thạch nghiờng 3 thỏng một lần. Để giữ giống lõu hơn cú thể bảo quản trong dung dịch 40% glyxerin vụ trựng và giữ trong cỏc ống effpendorf vụ trựng ở -200.
Phương phỏp xỏc định tốc độ sinh trưởng:
* Phương phỏp xỏc định độ đục: đo mật độ tế bào trong dịch nuụi cấy (Vũ thị Minh Đức-2001), ở OD600nm. Mẫu đối chứng là mụi trường khụng chứa tế bào vi sinh vật. Dựa vào số liệu đo được xõy dựng đường cong để xỏc định tốc độ sinh trưởng và xỏc định thời gian nấm men đạt đến giai đoạn cuối pha logarit.
* Phương phỏp xỏc định số lượng tế bào sống
Chuẩn bị mẫu: pha loóng dịch nuụi cấy bằng nước cất vụ trựng. Cấy trải dịch pha loóng lờn đĩa cú mụi trường thạch thớch hợp. Thớ nghiệm nhắc lại 3 lần dưới điều kiện vụ trựng. Nuụi ở điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của nấm men. Sau 2 ngày đếm số khuẩn lạc xuất hiện trờn đĩa.
Phương phỏp xỏc định nồng độ protein hũa tan: Phương phỏp Bradford,
hàm lượng protein tổng số được xỏc định theo Kelldal
Phương phỏp thu thành tế bào:
*Phương phỏp 1: cho dịch lờn men (15% w/v) tự phõn huỷ ở nhiệt độ 500C trong 24 giờ (Suphanthasika et all, 1997). Ly tõm 4500 vũng trong 10 phỳt, sau đú thu lượng chất rắn, chất rắn này cú trọng lượng khoảng 35% (w/w) đú là thành tế bào nấm men bia, giữ thành tế bào ở 40C cho đến khi sử dụng.
*Phương phỏp 2: cho dịch lờn men ly tõm 8000v/phỳt, trong 20 phỳt, rửa 2 lần bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. Hoà cặn tế bào trong 1 lớt 4% NaOH,
24
đun núng đến 1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phũng, thờm 1 lớt nước lạnh để dừng phản ứng. Ly tõm 4000 v/phỳt trong 15 phỳt. Thu cặn (thành tế bào) và bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng.
Phương phỏp tỏch chiết bờta-glucan tổng số
- Dựng lượng thành tế bào thu được như ở trờn chiết tiếp với NaOH 3,5%, ở 75OC trong 19 tiếng. Để nguội đến nhiệt độ phũng. Bổ sung nước cất với thể tớch tương đương thể tớch dịch chiết. Ly tõm thu cặn.
- Chiết cặn thu được với NaOH 3%, (chỉnh pH4,5 bằng HCl đặc), ở 100OC trong 1,5 tiếng. Ly tõm thu cặn.
- Rửa cặn 2 lần với cồn 96O, ly tõm thu cặn rồi rửa tiếp 1 lần nữa với dietyl ete.
- Để khụ sản phẩm trong tủ hỳt khoảng 48 giờ đến khối lượng khụng đổi. - Bảo quản sản phẩm trong tủ lạnh cho cỏc phõn tớch tiếp theo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương phỏp xỏc định gốc axit amin tự do trờn hệ HP-Amino Quant series II: theo phương phỏp của phũng Hoỏ -Sinh protein, viện CNSH
Phương phỏp xỏc định hàm lượng hexose tổng số trong mẫu glucan:
Hàm lượng hexose tổng số được xỏc định dựa vào đường cong chuẩn glucose. Chuẩn bị dung dịch glucose ở nồng độ dao động từ 10-100àg/ml. Hỳt 1ml dịch ở cỏc nồng độ khỏc nhau này vào mỗi ống nghiệm khụ, sạch, bổ sung 1ml phenol 5% sau đú bổ sung tiếp 5ml H2SO4 đặc. Với mẫu glucan cũng tiến hành tương tự và lựa chọn nồng độ sao cho thớch hợp.
Vortex đều sau đú ủ ở 37OC, trong khoảng 15-20 phỳt.
Xỏc định mật độ hấp phụ tối đa (OD) của mẫu ở bước súng 488nm.
Cỏc phương phỏp khảo nghiệm:
25
Gia cầm cho thớ nghiệm qui mụ nhỏ (phũng thớ nghiệm) và qui mụ vừa (trại thớ nghiệm): Gà, vịt, ngan (ngan lai Phỏp) được mua từ lỳc 1 ngày tuổi và
chia làm nhiều lụ thớ nghiệm. Tuỳ theo lụ, gia cầm được ăn thức ăn cú hoặc khụng bổ sung Beta-glucan; và được nuụi trong điều kiện sinh học đảm bảo suốt quỏ trỡnh thớ nghiệm.