- Bố trớ thớ nghiệm
2.2.2. Hoàn thiện lờn men cỏc chủng probiotics bổ sung
40
Vi khuẩn probiotic là vi sinh vật sống được thờm vào, ảnh hưởng cú ớch lờn vật chủ bằng cỏch thay đổi tập đoàn vi sinh vật xung quanh hoặc liờn kết với vật chủ, bằng cỏch tăng khả năng sử dụng thức ăn hoặc tăng giỏ trị dinh dưỡng của nú, bằng cỏch tăng phản ứng của vật chủ đối với bệnh hoặc bằng cỏch cải thiện chất lượng mụi trường xung quanh vật chủ.
Trong khi những nghiờn cứu về probiotic trong nuụi trồng thuỷ sản tập trung đầu tiờn vào cỏ con, gần đõy sự chỳ ý được chuyển sang ấu trựng cỏ và tụm, cua (động vật cú vỏ) và thức ăn sống. Động vật trờn cạn thừa hưởng phần quan trọng vi khuẩn định cư trước qua tiếp xỳc với mẹ, trong khi cỏc loài dưới nước thường đẻ trứng trong nước khụng cú sự tiếp xỳc tiếp theo với bố mẹ, điều này cho phộp vi khuẩn ở bờn ngoài bỏm vào vỏ trứng. Ngoài ra ấu trựng mới nở hoặc động vật mới sinh, hệ thống tiờu hoỏ chưa hoàn thiện và khụng cú tập đoàn vi sinh vật trong ruột, trong mang hoặc trờn da. Vỡ khu hệ vi sinh đầu tiờn trong những pha phỏt triển sớm của ấu trựng dưới nước phụ thuộc một phần vào nước nơi chỳng được nuụi dưỡng, thành phần vi khuẩn trong nước xung quanh cực kỳ quan trọng.
Chủng Lactobacillus acidophilus VN1:
Chủng Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn sinh axit lactic, tế bào hỡnh
que, thuộc nhúm vi khuẩn Gram +, khụng sinh bào tử; lờn men sinh amylaza, proteaza, lờn men đường lactoza, manoza, saccaroza và Glucoza.
Chủng giống được hoạt hoỏ trờn mụi trường MRS agar, nuụi trong tủ ấm 340C, sau 48 h khuẩn lạc mầu trắng sữa xuất hiện, trũn nhỏ và đều, bề mặt nhẵn búng. Chọn những khuẩn lạc mọc khỏe, cho vào ống nghiệm chứa 5ml mụi trường MRS, nuụi tĩnh ở 340C, sau 24h tiếp tục nhõn giống vào bỡnh tam giỏc hoặc bỡnh lờn men chứa mụi trường MRS, với tỷ lệ nhõn giống là 5%.
41
L. acidophilus được nuụi dưới 2 điều kiện khỏc nhau: (i) nuụi tĩnh trong
tủ ẩm trong cỏc bỡnh tam giỏc cú thể tớch 1000 ml; và (ii) lờn men trong hệ thống cú cỏnh khuấy với thể tớch từ 20 lớt trở lờn. Tốc độ khuấy giới hạn ở mức 50 vũng/phỳt, thời gian lờn men tối ưu 24 - 30 h, bổ sung chất phỏ bọt, pH mụi trường được điều chỉnh bằng NaOH. Sau 24 giờ và 48 giờ, xỏc định mật độ vi khuẩn (bảng 9).
Bảng 9: Xỏc định mật độ L.acidophilus VN1 dưới cỏc điều kiện nuụi khỏc nhau
24 h 48h
Điều kiện nuụi
CFU/ml OD 620 CFU/ml OD 620 Tĩnh 1,2x109 0.45 – 0.52 2.,7x108 0.64 - 0,7 Khuấy 50 v/p 3,17x109 0.51 – 0.6 5.4x108 0.7 – 0.76
Trong điều kiện nuụi cấy cú khuấy nhẹ, sinh khối tạo thành cao hơn so với điều kiện nuụi tĩnh. Thời gian nuụi cấy 24 - 30 h cho lượng sinh khối cao nhất. Việc khuấy nhẹ sẽ giỳp cho cỏc pha mụi trường và pha vi sinh được trộn đều, như vậy cỏc dưỡng chất được vi sinh vật sử dụng hết, và trỏnh được sự xuất hiện cỏc khu vực cú pH và nồng độ cỏc chất quỏ cao hay quỏ thấp, nhiệt độ khối dịch vỡ thế khụng làm ảnh hưởng tới quỏ trỡnh lờn men.
Sinh khối của L. acidophilus được thu hồi bằng phương phỏp ly tõm, sau đú đụng khụ để bảo quản.
Chủng Bacillus subtilis B1
B.subtilis được nuụi trong mụi trường MPB bổ sung muối khoỏng ở nhiệt
độ 370C với tỷ lệ nhõn giống 5%, pH mụi trường 7,2.
Thời gian để thu hồi sinh khối tốt nhất là sau 24 – 28 h lờn men.
B.subtilis là chủng hiếu khớ, vỡ vậy quỏ trỡnh lờn men được thực hiện ở chế
42
Bước 1: Hoạt hoỏ B. subtilis trờn mụi trường NA ( cao thịt 3 g/L; peptone 10 g/L; agar 20 g/L., lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch cho vào 5 ml mụi trường NB sau đú lắc 200 RPM ở 370c trong 24 h.
Bước 2: nhõn giống cấp 1 với tỷ lệ 10%, nuụi cấy ở điều kiện như trờn. Bước 3: Nhõn cấp 2 cũng tiến hành tương tự trong điều kiện của quỏ trỡnh nhõn giống cấp 1.
Bước 4: Tiến hành lờn men trong hệ thống cú cỏnh khuấy 200 rpm với dung tớch lớn từ 50 lit trở lờn, lưu ý với pH mụi trường sau 18 h lờn men cần bổ sung thờm HCl 1N, với tỷ lệ 17 ml cho 10 lớt dịch sinh khối để pH giữ ở trạng thỏi 7,2 – 7,6 là tối ưu cho quỏ trỡnh lờn men, sinh khối đạt được sau 24 h với pH tối ưu là 109 CFU.
Bảng 10: Đỏnh giỏ sự phỏt triển của B.subtilis B1 Thời gian
(giờ)
pH OD (λ = 550 nm)
Oxy hũa tan (%)
Quan sỏt dưới kớnh hiển vi
0 6,6 0,070 100 -
4 6,3 0,080 90 Bacilli đang phõn chia
8 7,3 0,280 87 Bacilli với nội bào tử
12 7,5 0,360 85 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 70% bào tử tự do
16 8,2 0,370 82 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 80% bào tử tự do
20 8,3 0,330 70 Bacilli với nội bào tử :
43
24 8,2 0,320 75 Bacilli với nội bào tử:
khoảng 98% bào tử tự do
Kết quả nhận được cho thấy chủng B.subtilis phỏt triển tốt ở 370C, pH 7,2- 7,6 sau 24 giờ lờn men thu sinh khối.
Bảng 11: Điều kiện lờn men tối ưu cho 2 chủng probiotics
Tờn chủng pH t 0 (C) T (h) vũng quay (RPM) Mụi trường Mật độ VSV (CFU/ml) Bacillus subtilis B1 7,2 37 24 200 MPB 109 Lactobacillus acidophillus VN1 6,4 34 26 0 MRS 10 9
Bảng 12: Thực hiện thu hồi và sản xuất nguyờn liệu bột probiotic
Tờn chủng Ly tõm RPM T0 (OC) Tỷ lệ trộn cơ chất (ml/g) pH Tỷ lệ muối cõn bằng (%) Đụng khụ Bacilus subtillis B1 6000 40c 1/6 7 Lactobacillus acidophillus VN1 6000 4 0c 1/3 7 Na2S2O3: 2,4 Lactose: 2 T0 = -500c P = 10-4 tor (Christ 5 lit)