- Làm phản ứng Mantoux, kiểm tra sẹo lao.
1) 16SF: GRG RTA CTC GAG TGG CGA AC 16SR: GGC CGG CTA CCC GTC GTC
16SR: GGC CGG CTA CCC GTC GTC
Mồi được thiết kế dựa trên trình tự mã hóa cho gien 16S rARN của vi khuẩn cho sản phẩm PCR có kích thước 208bp
2)16Sf: 5’TAATACCGGATAGGACCACGG 3’ 16Sr: 5’ GCGACGCTCACAGTTAAGCCGTG 3’
Mồi được thiết kế dựa trên trình tự mã hóa gien 16S rARN ở vùng đặc hiệu cho M.complex, cho sản phẩm PCR có kích thước 461bp.
Probe: Biotinated-ACC ACA AGA CAT GCA TCC CG, dặc hiệu cho Vi khuẩn lao 16S rARN.
.Tách chiết ARN của vi khuẩn lao:
- Hóa chất phản ứng: sử dụng kít tách chiết ARN của Qiagien-Mỹ
Bộ Kít gồm: đệm TE, pH8.0; đệm RLT; đệm RPE; đệm RW1; Ethanol (96 – 100%); nước RNase-free.
- Các bước tiến hành:
+ Cho 100µl đệm TE chứa lysozym (3mg/ml) vào mẫu, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. + Bổ sung 350µl đệm RLT, trộn mẫu. Ly tâm 12.000rpm trong 2 phút, lấy nước nổi cho vào tuýp mới.
+ Cho vào 50µl ethanol để hòa tan, trộn đều bằng pipette.
+ Lấy 700µl mẫu thu được cho vào tuýt 2ml. Ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước.
+ Cho vào 700µl đệm RW1, ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước. + Tiếp tục bổ sung 500µl đệm RPE, ly tâm 10.000rpm trong 15 giây, loại nước. + Cho vào 500µl đệm RPE, ly tâm 10.000rpm trong 2 phút, loại nước + Bổ sung 50µl nước RNase-free, ly tâm 10.000rpm trong 1 phút.
Xử lý ADN còn lẫn trong ARN
+ 10µl đệm DNA, 5µl RNase inhibitor, 10µl DNase; ủở 370C trong 30 phút. + Bổ sung 6µl EDTA (25µM) ủ ở 700C trong 10 phút, nhằm phá hủy DNase còn lại.
Phản ứng RT-PCR:
- Phản ứng RT: cho vào mỗi ống PCR 10µl dung dịch ARN, 4µl đệm PCR, 10pmol mồi đặc hiệu cho phiên mã ngược trình tự mARN của Vi khuẩn lao, 1µl dNTP (40µM), 0.5µM BSA, 1µM RNase inhibitor, 2.5U reverse trancriptaza trên tổng số 20µl dung dịch phản ứng; ủ 420C trong 1 giờ.
- Phản ứng PCR: phương pháp PCR sử dụng digoxigienin dUTP. Thành phần phản ứng bao gồm 1,5mM MgCl2 , 0,2µM mồi 16S R, 200µM dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 1,5 đơn vị tag polymerase, 5µl dịch cADN mẫu, 2,4nmol diogoxigienin-dUTP, bổ xung nước cất vô trùng vừa đủ 50µl dung dịch phản ứng.
+ Chứng dương: chủng H37rv
+ Chứng âm: nước DEPC (nước đã được xử lý RNase) + Chương trình PCR
Bước 1: 940C trong 10 phút
Bước 2: lặp lại 35 chu kỳ sau: 940C trong 1,5 phút, 660C trong 2 phút, 720C trong 3 phút
Bước 3: 720C trong 20 phút
Cặp mồi 16Sf-16Sr được thiết kế để nhân bản trình tự ADN có kích thước 461bp nằm trong vùng trình tự mã hóa cho gien 16S rARN của vi khuẩn. Qua tính toán, dựa trên nhiệt độ biến tính (Tm) của cặp mồi, chúng tôi sử dụng nhiệt độ lai trong phản ứng PCR là 660C.
Phát hiện sản phẩm PCR qua điện di:
- Đun agaroza 2% trong dung dịch đệm TBE 0,5X.
- Để nguội thạch đến nhiệt độ khoảng 560C, cho 2µl ẹthidium bromide nồng độ 10mg/ml, lắc đều, sau đó đổ thạch agaroza vào khuôn và tạo giếng bằng tấm lược nhựa.
- Khi thạch đông, cho ít nước lên mặt thạch sau đó nhẹ nhàng rút lược ra và đặt thạch vào hộp điện di.
- Đổđệm TBE 0,5X vào hộp điện di cho ngập trên mặt thạch khoảng 1mm. - Trộn đều 10µl sản phẩm PCR trong 3ml loading buffer và cho vào các giếng của bản gel.
- Nối hộp điện di với bộ nguồn sao cho ADN di động theo chiều dòng điện từ cực âm đến cực dương, với hiệu điện thế 94V.
- Điện di kết thúc, quan sát kết quả trên máy soi thạch và chụp ảnh.
Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài là 461bp.
Phản ứng lai bằng ELISA:
Để khẳng định chắc chắn mẫu thí nghiệm là dương tính với chủng
M.tuberculosis, chúng tôi đem các sản phẩm PCR dương tính chạy ELISA
2.2.5. Xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu thập được xử lý bằng phần mềm EPI – INFO 6.04, phần mềm GraphPad Prismvà áp dụng phương pháp thống kê y sinh học.
2.2.6. Hạn chế sai số trong nghiên cứu.
- Chọn điều tra viên là những nhân viên y tế có kinh nghiệm, được tập huấn kỹ.
- Chọn các bác sỹ chuyên khoa lao, có nhiều năm kinh nghiệm trong chẩn đoán và điều trị bệnh lao phụ trách khám lâm sàng.
- Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh lao dùng trong nghiên cứu theo đúng tiêu chuẩn của Chương trình Chống lao Quốc gia quy định.
- Giai đoạn trước và sau nghiên cứu đều dùng một loại Tuberculin tiêu chuẩn là Tuberculin PPD RT23+Tween80 2TU do Viện Huyết thanh quốc gia Copenhagien, Đan Mạch sản xuất.
- Kỹ thuật viên thử phản ứng Mantoux và đọc kết quả là kỹ thuật viên chuyên khoa, được đào tạo, tập huấn theo chương trình chống lao quốc gia và có kinh nghiệm lâu năm trong lĩnh vực này.
- Xử lý chống nhiễm kỹ thuật PCR theo đúng quy trình.
2.3. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu