- Làm phản ứng Mantoux, kiểm tra sẹo lao.
2.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy (tiến hành tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Phổi Trung ương)
Trung ương)
Dụng cụ và hóa chất
- Dung dịch Natri hydroxit (NaOH) 4%
- Chất dinh dưỡng ODAC: Bovine abumin, Dextroza, Catalaza, acid oleic
- Hỗn hợp kháng sinh PANTA: Polymixin B, Amphotericin B, acid nalidixic, Trimethoprim, Azlocillin
- Dung dịch fuchsin phenic o,3%
- Dung dịch cồn acid 25% - Dung dịch XanhMethylen - Ống ly tâm 50ml - Eppendorf 1,5ml - Môi trường Chuẩn bị bệnh phẩm
- Mẫu không khí (gelatin): cho mẫu vào một ống 50ml có nắp xoáy, thêm 03ml nước muối sinh lý, ngâm trong 15 phút, sau đó lắc cho đến khi tan hoàn toàn.
- Mẫu tăm bông: cho vào ống chứa mẫu 03ml nước muối sinh lý, ngâm 15 phút, lắc thật kỹ, sau đó dung pipette Pasteur hút hết dung dịch mẫu sang 1 ống 50ml vô khuẩn.
- Nước thải: cho 2,5ml nước muối sinh lý, 500µl nước thải sau xử lý vào 1 ống 50ml có nắp xoáy, ngâm 15 phút, lắc kỹ.
Xử lý bệnh phẩm
- Thêm 1 thể tích NaOH 4% bằng với thể tích bệnh phẩm đựng trong ống nghiệm.
- Lắc trên máy lắc cho đến khi bệnh phẩm tan ra hoàn toàn. Để ống nghiệm đứng thẳng 15 phút ở 370C để khử tạp khuẩn.
- Thêm 40ml nước muối sinh lý, ly tâm 15 phút (3000 vòng/phút)
- Thêm 01ml nước muối sinh lý, lắc kỹ. Dung dịch này để cấy vào môi trường Loeweinstein – Jensen, môi trường MGIT và nhuộm Ziehl – Neelsen để tìm vi khuẩn lao.
Nuôi cấy trên môi trường Loeweinstein – Jensen:
- Cấy vào môi trường:
+ Cấy vào môi trường Loeweinstein – Jensen mỗi ống 5 giọt cặn đã trung hòa, láng đều trên bề mặt của mỗi ống môi trường.
+ Đểống môi trường nằm nghiêng trên giá nằm.
+ Giữ ở nhiệt độ 35 – 370C (mở lỏng nắp 1 tuần để làm khô và cung cấp đủ không khí cho nuôi cấy vì vi khuẩn lao là vi khuẩn hiếu khí).
+ Khi bề mặt môi trường đã khô, đóng chặt nắp tiếp tục ủấm từ 4-8 tuần.
- Đọc kết quả: sau 3 ngày, 7 ngày, 4 tuần và 8 tuần. Đọc sau 3 ngày để bỏ đi những ống nuôi cấy bị nhiễm trùng, sau 7 ngày để phát hiện khuẩn lạc mọc nhanh, sau 4 tuần để phát hiện khuẩn lạc mọc chậm, sau 8 tuần không thấy có khuẩn lạc mọc trên môi trường thì mẫu âm tính.
- Ghi kết quả:
+ Âm : không có khuẩn lạc.
+ 1+ : 1 – 200 khuẩn lạc, ghi số khuẩn lạc (ví dụ +12).
+ 2+ : ½ môi trường khuẩn lạc mọc dày không đếm được, tương ứng 200 – 500 khuẩn lạc.
+ 3+ : 3/4 môi trường khuẩn lạc mọc dày không đếm được, xấp xỉ 500 – 2000 khuẩn lạc.
+ 4+ : khuẩn lạc mọc dầy đặc toàn bộống môi trường, xấp xỉ 2000 khuẩn lạc.
- Khi nuôi cấy có khuẩn lạc mọc, làm phản ứng sinh vật hóa học đểđịnh danh vi khuẩn mọc trên môi trường (Niacin)
Ảnh 2.2: Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường Loeweinstein - Jensen
Nuôi cấy trên môi trường MGIT
+ Thêm 0,5ml ODAC (chất dinh dưỡng) và 0,1ml PANTA (hỗn hợp kháng sinh) vào ống môi trường MGIT.
+ Lấy 0,5ml bệnh phẩm đã xử lý cấy vào ống môi trường MGIT. + Đóng chặt nút, lắc trộn đều, giữở tủấm 370C.
Đọc và ghi kết quả:
+ Đọc kết quả hàng ngày bằng đèn cực tím có bước song 365 nm, bắt đầu từ ngày thứ 2 sau nuôi cấy.
+ Kết quả âm tính: ánh sáng huỳnh quang yếu hoặc không có (tiêp tục kiểm tra hàng ngày cho tới 8 tuần mới được kết luận âm tính).
+ Kết quả dương tính: ánh sáng có màu vàng da cam hoặc được phát hiện bởi độđục không đồng nhất hay những hạt nhỏ trong môi trường nuôi cấy.
+ Các mẫu dương tính được tiếp tục làm phản ứng vi sinh vật hóa học đểđịnh danh vi khuẩn (Niacin).
Ảnh 2.3: Nuôi cấy vi khuẩn lao trên môi trường MGIT