- Làm phản ứng Mantoux, kiểm tra sẹo lao.
2.2.4.3. Thử nghiệm tích luỹ niacin để định danh vi khuẩn lao.
Nguyên lý: Tất cả các vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp niacin, nhưng chúng cũng có enzyme chuyển hóa niacin thành niacin ribonucleotide, vi khuẩn lao không có enzyme chuyển hóa, nên sản phẩm này được tích lũy trong môi trường nuôi cấy và có thể phát hiện bằng phản ứng hóa học với cyanogienbromur khi có mặt của aniline sẽ tạo phức hợp màu vàng hoàng yến nhận biết được bằng mắt thường. Vì vậy xác định niacin tích lũy trong môi trường nuôi cấy là một thử nghiệm rất có giá trịđể nhận biết vi khuẩn lao.
Dụng cụ và hóa chất: - Anilin tinh khiết.
- Cyanogien bromide 10%.
- Dụng cụ vô khuẩn: ống nghiệm cỡ 12, Pipette Pasteur.
Các bước thực hiện:
- Nhỏ vào ống nuôi cấy dương tính (42 ngày) 1ml nước cất vô trùng. Để nước ở một độ nghiêng sao cho nước phủ kín bề mặt nuôi cấy, giữở 370C trong 20 phút. - Hút hết huyền dịch này cho vào một ống nghiệm vô trùng.
- Thêm 01ml cyanogiens bromide 10%, để 5 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính: có màu hoàng yến. - Phản ứng âm tính: không có sựđổi màu. - Chứng dương tính: chủng H37Rv.
- Chứng âm tính: chủng Mycobacteria avium.
2.2.4.4. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lao (thực hiện tại phòng Miễn dịch, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
Tách ADN của vi khuẩn lao trong mẫu (theo phương pháp Boom)
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc dung Guanidin thiocyant (GuSCN) để ly giải hoạt tính nucleaza, các ADN trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờđó phá vỡ tế bào và tinh khiết được ADN từ mẫu bệnh phẩm.
Hóa chất phản ứng:
- Huyền dịch silica.
- Dung dịch ly giải L6: 5M GuSCN; 50mM Tris-HCL, pH6,4; 20mM EDTA, pH8; 0,1% Triston X-100.
- Dung dịch rửa L2: 5M GuSCN; 50 mM Tris-HCL.
- Dung dịch rửa etanol 70%.
- Dung dịch acetone.
- Dung dịch TE: 10mM Tris-HCL và 1mM EDTA pH8,3.
- ProK-Prep: protein K/detergient.
Chuẩn bị bệnh phẩm:
- Mẫu không khí (gelatin): hòa mỗi mẫu với 3ml nước siêu sạch, lắc kỹ cho đến khi tan hoàn toàn.
- Mẫu tăm bông gelatin: cho 600µl nước siêu sạch vào các eppendorf đựng các mẫu tăm bông, lắc kỹ cho gelatin cố định vi khuẩn được bọc ngoài các tăm bông tan hoàn toàn.
- Mẫu nước thải: lấy nước thải sau xử lý.
- Chứng dương: chủng H37Rv.
- Chứng âm: nước siêu sạch.
Các bước tiến hành:
- Cho 100 µl mẫu, 10 µl ProK-prep vào một eppedorf vô khuẩn, ủ 560C trong 2 giờ.
- Trong 1 tube Eppedorf nắp khóa 1,5ml, cho vào 900 µl L6, 30 µl Silica và 100 µl bệnh phẩm đã được xử lý với ProK-prep. Voltex hỗn dịch này và sau đó lắc ngang 100rpm hay lắc tay úp ngửa trong 10 phút. Voltex lần nữa trong 5 giây và ly tâm 13.000 rpm trong 15 giây.
- Dùng máy hút chân không hút bỏ phần nước nổi. Để tránh mất Silica, chừa lại khoảng 10 µl trên lớp Silica.
- Rửa 2 lần, mỗi lần với 01ml đễm rửa L2.
- Rửa tiếp 2 lần, mỗi lần với 01ml etanol 70%, sau đó 1 lần với 01ml acetone.
- Hút bỏ phần nước nổi sau đó làm khô Silica ở 560C trong khoảng 10 phút trong máy ủ nhiệt.
- Thêm 60µl đệm TE. Voltex cho đến khi Silica tan hoàn toàn. Ủ ở 560C trong khoảng 10 phút. Ly tâm 13.000rpm trong 2 phút, hút cẩn thận 40-50µl dịch nổi vào một tube Eppedorf mới.
- Thêm 40µl TE vào cặn Silica. Voltex, ủ 10 phút ở 560C, ly tâm 13.000rpm trong 2 phút, hút cẩn thận 20 – 30 µl dịch nổi vào tube trước đó để có dung dịch cuối cùng.
Tiến hành phản ứng PCR (theo phương pháp của A.H.J.Kolk)
Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên sự khuyếch đại một đoạn ADN kích thước 249bp nằm trên đoạn chèn IS 6110 của Vi khuẩn lao, cặp đoạn mồi INS2/Pt18.
Sử dụng bộ kít chuẩn TB PCR kít (Nam Khoa, Việt Nam) gồm các thành phần: PCR buffer, Tag polymerase, dNTP, cặp đoạn mồi INS2/Pt18 đặc hiệu cho IS 6110 của Vi khuẩn lao (cho sản phẩm khuyếch đại 249bp), UDG và dUTP (giữở -200C cho đến khi dùng).
Cho mẫu vào ống phản ứng:
- Cho 10 µl dịch tinh khiết ADN từ bệnh phẩm vào ống PCR chứa 40 µl hỗn hợp phản ứng.
- Chứng dương: chủng H37Rv. - Chứng âm: dung dịch TE.
Chạy chương trình luân nhiệt gồm:
- Bước 1: 400C trong 10 phút.
- Bước 2: lặp lại 40 lần chu kỳ sau: 940C trong 1,5 phút; 650C trong 2 phút; 720C trong 3 phút.
- Bước 3: 720C trong 30 phút.
Phát hiện sản phẩm PCR qua điện di:
Đun agaroza 2% (dung dịch TBE 10X: 2,5ml; nước siêu sạch: 50ml; agaroza: 1g) bằng lò vi song. Để hạ nhiệt độ đến 560C, cho 2 µl Ethidium bromide nồng độ 10mg/ml, lắc đều, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch TBE 0,5. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 94V, cho đến khi loading buffer chạy cách giếng 3cm. Quan sát trên máy soi gel và chụp ảnh.
Do PCR có độ nhạy cao (có thể phát hiện được 10fg tương đương 1-3 vi khuẩn trở lên) nên kết quả cần được phân tích, đánh giá so với chứng âm (chỉ có dung dịch phản ứng) và chứng dương (ADN của Vi khuẩn lao).
Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài là 249bp.
2.4.4.5. Kỹ thuật RT – PCR khuyếch đại trình tự 16S rARN, ELISA phát hiện vi khuẩn lao sống.
Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên sự phiên mã ngược một đoạn ARN từ rARN của Mycobacterium thành cDNA rồi sau đó dung PCR khuyếch đại cDNA thành các sản phẩm có kích thước 208bp (cặp mồi thứ 1) và 461bp (cặp mồi thứ 2). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai cặp mồi khác nhau để khuyeesch đại 16S rARN của vi khuẩn nói chung (sử dụng cho các mẫu thu thập trước can thiệp) và của Vi khuẩn lao complex nói riêng (dùng cho các mẫu thu thập sau can thiệp).
Mồi và mẫu dò (probe) dùng cho phản ứng PCR-ELISA: