Hình 5: Cấu trúc và sự biểu hiện của Ti-plasmid kiểu octopine và kiểu nopaline. A. Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) và kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối và kích
thước của các vùng chức năng chính. Các vị trí tô đậm chỉ các vùng tương đồng lớn của 2 plasmid:
CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp; ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản. B. Bản đồ của vùng T kiểu nopaline và octopine cho thấy các vùng chức năng chính, các vùng tương
đồng và các sản phẩm phiên mã [13].
A. tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (hình 4). Mô khối u tổng hợp amino axit và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine. Trong opine người ta phân biệt hai loại octopine và nopaline (hình 5). Một số chủng vi khuẩn A. tumefaciens chứa Ti-plasmid của loại octopine và một số khác là của nopaline. Những plasmid octopine chỉ có thể tạo octopine và phân giải chúng, nhưng không tạo và phân giải được nopaline [14].
Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng
khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginin và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline [16].
Có sự khác nhau giữa các loại plasmid ở Agrobacterium, đó là Ti-plasmid của loại nopaline chỉ chứa một bản sao (copy) của T-DNA, trong khi plasmid octopine chứa đến ba bản sao. Ở trên đoạn T-DNA định vị những gen tổng hợp opine và tạo khối u. Khối u được tạo nên là do hai loại phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa (callus) [14].
Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm [4]. Sự sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro [16].
Điều này cho phép kết luận: vi khuẩn đã chuyển vào cây tác nhân gây khối u dưới dạng vật chất di truyền. Các thực nghiệm cho thấy khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn A. tumefaciens không mang plasmid thì không gây bệnh u và u chỉ xuất hiện khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn mang plasmid. Như vậy plasmid của A. tumefaciens chính là tác nhân gây bệnh. Người ta đã khẳng định các plasmid nói trên cần thiết cho việc tạo khối u, vì vậy chúng được gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid) [14].
Ti-plasmid
Ti-plasmid là các vòng DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,…Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập [15].
Hình 6: Sơ đồ cấu trúc của Ti-plasmid [90].
Ti-plasmid là một plasmid lớn 200kb, chúng được duy trì ổn định trong
Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30°C [16]. Trên Ti-plasmid có đoạn T- DNA có được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) (hình 6). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. Đoạn này được gọi là T-DNA vì đây là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh khối u. T-DNA của vi khuẩn được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với gen nhân (tế bào thực vật). T-DNA ổn định trong gen nhân.Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên [4].
Vùng vir: là vùng chứa các Gen vir (virulence gene) mã hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật.
Vùng CON: vùng mã hóa chức năng tiếp hợp
Vùng ORI: vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi điểm tái bản.
T-DNA
Ti-plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những tế bào thực vật bị thương, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA (transfer-DNA). T-DNA là một phần của Ti-plasmid, được chuyển vào thực vật. Trên đó định vị những gen
(LB: left border và RB: right border). Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA được đưa vào DNA trong nhân tế bào thực vật. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép [14].
Đó là một đoạn DNA trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine là các gen gây khối u (oncogenes). Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism).
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinine.
Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmid. Vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh. Trên thực tế Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây một lá
mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của vi khuẩn Agrobacterium vào cây một lá mầm [16].
b. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trước hết là tế bào bị thương. Khi tế bào bị thương chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringone), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và gắn kết vi khuẩn với tế bào thực vật. Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A. tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ có ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium chỉ được sử dụng hạn chế cho việc biến nạp gen ở cây một lá mầm. Khi bổ sung syringone người ta có thể biến nạp gen vào nấm nhờ A. tumefaciens [4].
Hình 7: Cơ chế biến nạp của Agrobacterium vào tế bào thực vật [95].
Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (hình 7). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn [14].
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn như: AS,... Dưới tác dụng của các hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. Quá trình này được sự trợ
giúp đặc biệt của các gen vir và bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border). Cũng chính các hợp chất này là AS,... với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Sự tiếp xúc của A. tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình này một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS. Gen virA và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp. Khi A. tumefaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC. Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, virC, virD và virE không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-DNA và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch thẳng tương ứng với T-DNA. Các sản phẩm của operon virD có hoạt tính endonuclease [16]. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào DNA nhân.