MMS có chứa 400 mg/l cefotaxime (C400), các mẫu FEC được chuyển sang môi trường MMS chứa kháng sinh hygromycin ở nồng độ thấp 10mg/l (MMS + C400 + H10) trong 1 tuần; sau đó tăng dần nồng độ hygromycin lên mỗi tuần sau đó (MMS + C400 + H15, rồi MMS + C400 + H20). Cuối cùng chuyển sang môi trường tái sinh MSN + C400 + H20 và theo dõi, do hygomycin bị phân hủy bởi nhiệt và ánh sáng nên sau khi chuyển FEC sang môi trường tái sinh phải 2 tuần/lần cấy chuyển sang môi trường mới. Quá trình này tạo ra một môi trường ngày càng khắt khe cho phép các cụm FEC biểu hiện gen kháng kháng sinh và bắt đầu phân chia tế bào. Bắt đầu theo dõi quá trình chọn lọc và ghi nhận kết quả sau 3 lần biến nạp (mỗi lần biến nạp sử dụng 100 mg FEC cho mỗi vector):
Bả ng 7: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường chứa hygromycin
TN0
Lượng FEC được
chọn lọc (mg) Tỷ lệ cụm FEC nảy mầm (%)
Số cây tái sinh (cây)
Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303
1 100 100 36,7 ± 1,2 19,3 ± 1,4 7 2 2 100 100 36,1 ± 1,0 19,8 ± 1,0 5 3 3 100 100 37,0 ± 1,2 20,1 ± 1,2 6 1
Trong giai đoạn chọn lọc, để tạo điều kiện cho các cụm FEC yếu sau đồng nuôi cấy có thời gian hồi phục và làm quen dần trên môi trường chọn lọc, trong tuần đầu tiên các cụm FEC chuyển gen được chọn lọc trên môi trường MMS ở nồng độ hygromycin thấp 10 mg/l, do đó các cụm FEC đều vẫn tươi và có sự phân chia tăng sinh về kích thước. Sang tuần thứ 2 nồng độ hygromycin được tăng dần lên 15mg/l bắt đầu có một vài cụm FEC dừng tăng sinh và hơi sậm màu hơn. Đến tuần thứ 3 tiếp tục nâng nồng độ hygromycin lên 20 mg/l thì chỉ còn một số cụm FEC vẫn tiếp tục nhân lên, hầu hết các cụm FEC còn lại đều không nhân lên và trở nên sậm màu (hình 19).
Hình 19: Kết quả chọn lọc và tái sinh FEC trên môi trường tái sinh (MSN) chứa hygromycin qua các giai đoạn khác nhau.
Khi chuyển sang môi trường tái sinh (MSN + C400 + H20) ở tuần thứ tư thì hiệu quả chọn lọc của hygromycin bắt đầu thể hiện rõ rệt hơn, một vài cụm đang phân chia bắt đầu chuyển sang giai đoạn biệt hóa thành các dạng phôi thứ cấp, các cụm còn lại bắt đầu chết và đen dần. Ở giai đoạn tái sinh này, cứ sau 2 tuần tiếp tục
chuyển các cụm FEC sang môi trường tái sinh mới (MSN + C400 + H20). Đến tuần thứ 6 các phôi bắt đầu nảy mầm và bắt đầu xuất hiện các cụm lá xanh (hình 19) với tỷ lệ tái sinh của các cụm giả định mang gen Dof1 và các cụm mang vector trống p1303 tương ứng là 36,67% và 19,33%. Từ các cụm lá này, sau 2 tuần tiếp theo bắt đầu xuất hiện các chồi thật ở tuần thứ 8 (hình 19). Sự nảy mầm của phôi soma được đi kèm bởi sự hoạt động biểu hiện của vô số các gen mã hóa quang hợp và các thành phần của lục lạp [19]. Thời gian khác nhau trong kích hoạt của các gen này có thể gây ra sự thay đổi trong sự nảy mầm của phôi soma giống sắn TMS 60444. Các dòng chuyển gen được tái sinh trong khoảng thời gian 3-4 tháng sau khi đồng nuôi cấy.
Kết quả chúng tôi đã thu được 18 dòng T0 (được đánh số từ dòng D1-D18) và 6 dòng T0 (đánh số từ T1-T6) giả định đã mang tương ứng vector mang gen Dof1 và mang vector trống p1303, do các cây này có khả năng kháng lại và sống sót trên môi trường chọn lọc với 20mg/l hygromycin. Kết quả này tương đương với kết quả của Taylor và cs (2012) thu được 14-28 dòng chuyển gen trên mỗi cm3 khối lượng ổn định FEC của TMS 60444 nhưng thấp hơn của Bull và cs (2009) với 50 dòng chuyển gen từ 100 cụm FEC giống sắn TMS 60444. Các kết quả nghiên cứu từ trước cùng với kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng, sự tái sinh của cây sắn từ phôi soma là một việc hết sức khó khăn, đặc biệt là do tần số nảy mầm của phôi thấp.
Khi các cây con thu được đã có chiều cao khoảng 1-2 cm tiến hành cắt và chuyển các cây này sang môi trường kéo dài chồi (CEM) để tạo cây hoàn chỉnh.