cây sau chuyển gen
Kết quả sàng lọc thông qua kiểm tra sự tạo rễ:
Sau khi thu được các dòng chuyển gen, để xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc nhanh các dòng chuyển gen kháng hygromycin bằng cách cắt các chồi ngọn cấy chuyển sang môi trường MS + C400 + H20 để kiểm tra sự ra rễ [84]. Để đảm bảo môi trường sàng lọc có hiệu quả, các cây TMS 60444 chưa chuyển gen cũng được sử dụng như đối chứng âm.
Theo dõi kết quả sau 2 tuần cho thấy 100% cây chuyển gen đã phát triển rễ mới (và số lá cũng nhiều hơn) trên môi trường chứa hygromycin, trong khi các cây không được chuyển gen vẫn không có rễ và cuối cùng cây không sinh trưởng được, mất màu và chết (hình 20). Điều này chứng tỏ gen đã được chuyển vào trong cây nên các cây này có khả năng kháng lại hygromycin và vẫn sinh trưởng tốt. Còn các cây đối chứng không chuyển gen, do trong hệ gen của cây không có gen kháng hygromycin nên nhanh chóng mất màu và chết trên môi trường chứa chất kháng sinh này.
Việc kiểm tra sự ra rễ là một bước sàng lọc nhanh chóng và chính xác sự khác biệt giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen trước khi tiến hành .
Hình 20: Kết quả kiểm tra sự ra rễ của cây chuyển gen Dof1 trên môi trường chứa kháng sinh hygromycin
Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây sắn chuyển gen Dof1
Thí nghiệm sàng lọc sự ra rễ trên môi trường chứa hygromycin đã chứng tỏ gen đã được chuyển vào cây. Tuy nhiên đây chỉ là kết quả tạm thời. Mặc dù hiệu suất chuyển gen không cao nhưng biểu hiện của gen chuyển trong phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens lại rất bền vững nhờ gen đích được gắn trực tiếp vào bộ gen của tế bào thực vật.
Vì vậy, sau khi sàng lọc trên môi trường MMS chứa hygromycin, các cây chuyển gen sống sót sẽ được tách DNA tổng số của các cây chuyển gen thu được phục vụ cho việc phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 và gen HPT trong cây. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết bằng CTAB của CIAT và tách thành công DNA tổng số từ mô lá non của cây sắn chuyển gen Dof1 và cây chuyển
vector trống p1303 mang gen chỉ thị HPT. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 21:
Hình 21: Kết quả điện di DNA tổng số kiểm tra cây chuyển gen Dof1. Giếng 1-18:
DNA tổng số cây TMS 60444 chuyển gen Dof1; Giếng 19-24: DNA tổng số cây TMS 60444 chuyển vector p1303 mang gen HPT
Hình ảnh điện di và nhuộm ethidium bromide cho thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao, ít bị đứt gãy và sạch. Một số mẫu tuy có vệt đứt gãy nhưng băng vẫn sáng rõ, cả 24 mẫu đều đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của các gen chuyển trong cây
Để phát hiện sự có mặt của gen chuyển Dof1 và HPT, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR kiểm tra các mẫu DNA tổng số đã tách sử dụng cặp mồi Dof1 F3/Dof1 R3 và HPT F3/ HPT R3 bắt cặp đặc hiệu với trình tự 35S promoter và Nos terminator nằm trên cấu trúc T-DNA của pCAMBIA Dof1 và pCAMBIA 1303 với đối chứng dương là plasmid chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA
Dof1 và chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA 1303 và đối chứng âm là DNA tổng số của cây đối chứng không chuyển gen. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 245 nm. Kết quả điện di được minh họa trong hình 22 và hình 23:
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HPT trong các cây chuyển gen. Giếng M: thang chuẩn 1kb; Giếng 1-9 và 13-21: mẫu DNA tổng số cây
chuyển gen Dof1; Giếng 10-12 và 22-24: mẫu DNA tổng số cây chuyển vector trống p1303; Giếng
(+): plasmid vi khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1; Giếng (++): plasmid vi khuẩn mang vector
Kết quả trên ảnh điện di (hình 22 và hình 23) cho thấy:
Giếng (-): tất cả các giếng đối chứng âm (sử dụng nước tinh khiết thay cho ADN) không xuất hiện băng, chứng tỏ hỗn hợp phản ứng PCR không bị nhiễm tạp.
Giếng (--): sử dụng ADN tổng số của cây kiểu dại làm khuôn cho phản ứng PCR, kết quả điện di không thấy xuất hiện băng. Giếng (+) và (++): sử dụng plasmid của khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1 (mang gen Dof1 và gen chỉ thị HPT) và plasmid khuẩn mang vector trống pCAMBIA 1303 (chỉ mang gen chỉ thị HPT), kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi HPT F3/ HPT R3 tất cả các giếng đều lên băng sáng rõ, còn sản phẩm PCR với cặp mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 thì chỉ plasmid của khuẩn mang vector pCAMBIA Dof1 lên băng còn plasmid của khuẩn mang vector pCAMBIA 1303 không lên băng, chứng tỏ các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR đặc hiệu cho gen Dof1 và gen chỉ thị HPT.
Các giếng từ 1-24 (hình 22) và giếng 1-18 (hình 23): sử dụng DNA tổng số của các cây chuyển gen làm khuôn cho phản ứng PCR, băng ADN thu được có kích thước mong đợi, sáng và rõ nét, chứng tỏ gen đã được chuyển thành công vào cây sắn TMS 60444. Do đó, chúng tôi sử dụng các dòng cây chuyển gen này để nhân vô tính tạo số lượng lớn hơn trước khi đưa ra vườn ươm trồng và đánh giá các đặc tính nông sinh