a. Phương pháp sàng lọc nhanh khả năng tạo rễ
Để xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc nhanh các dòng chuyển gen kháng hygromycin bằng cách: sau khi thu được các chồi chuyển gen, cắt các chồi ngọn cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung cefotaxime và hygromycin ở nồng độ thích hợp để kiểm tra sự ra rễ [84]. Để
đảm bảo môi trường sàng lọc có hiệu quả, các cây TMS 60444 chưa chuyển gen cũng được sử dụng như đối chứng âm.
b. Sử dụng phương pháp phân tích PCR (Polymerase chain reaction):
Các cây sau khi tái sinh được thành cây hoàn chỉnh sẽ tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA theo phương pháp của Gilberston và cs [34] và phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1.
Sau khi thu được mẫu DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 để kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong cây như sau:
- Chuẩn bị các ống PCR có chứa các thành phần sau:
Bả ng 4: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3
Thành phần phản ứng Thể tích
(µl) Điều kiện
Nước 17,375 - Thời gian biến tính ban đầu: Đệm Taq DNA polymerase 10x
(Biolab) 2,5 95
0C, 5 phút.
dNTP mix (2mM mỗi loại) 0,5 - Lặp lại 35 chu kỳ, mồi chu kỳ gồm 3 bước:
Mồi Dof F3 10 µM 0,5 + Biến tính: 950C, 30 giây. Mồi Dof R3 10 µM 0,5 + Gắn mồi: 600C, 30 giây. DMSO 2,5 + Tổng hợp: 680C, 40 giây.
Taq DNA polymerase Biolab 0,125 - Thời gian tổng hợp sau cùng : DNA khuôn 1,0 680C, 5 phút.
Tổng 25,0