ngoài đồng ruộng
Tiến hành thí nghiệm mô tả và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp so với cây đối chứng không chuyển gen với các mốc thời gian là 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng sau khi trồng cây ra nhà lưới và giai đoạn thu hoạch.
+ Sau trồng 3 tháng: Các chỉ tiêu được mô tả đánh giá bao gồm: Màu lá non, màu lá mở đầu tiên, lông ở ngọn lá, tập tính sinh trưởng của cây non.
+ Sau trồng 6 tháng: Mô tả các chỉ tiêu: Số lượng thùy lá, dạng thùy trung tâm, màu sắc lá, gân lá, màu sắc cuống lá, hướng cuống, chiều cao cây, sự phân chạc, .... Đối với các tính trạng định tính: màu sắc lá, gân lá, màu thân, hình dạng lá,... dựa vào tài liệu của Fukuda và cs (2010) làm cơ sở mô tả đánh giá.
Đối với các tính trạng định lượng: Chiều cao cây (cm): Đo từ phần mặt đất đến đỉnh của tán cây.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444
Về mặt lý thuyết, bất kỳ bộ phận nào thu được từ bất kỳ loài thực vật nào cũng có thể được sử dụng để tạo ra các mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công của quá trình tạo mô sẹo phụ thuộc vào tính chất đặc trưng của chúng. Việc sử dụng bộ phận nào làm nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến mức độ thành công và hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Các bộ phận khác nhau của cây đều có thể được sử dụng, tuy nhiên những bộ phận cây non thường được sử dụng và cho hiệu quả cao nhất. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 loại nguyên liệu là chồi nách từ thân và thùy lá non từ chồi đỉnh của cây sắn in vitro để nghiên cứu khả năng tạo FEC của giống sắn TMS 60444. Kết quả thu được thể hiện trên bảng 5 như sau:
Bả ng 5: Kết quả tạo FEC từ chồi nách và thùy lá non cây sắn TMS 60444 in vitro
Loại vật liệu Lần TN0 Số mẫu Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ trung bình tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ tạo FEC (%) Tỷ lệ trung bình tạo FEC (%) Chồi nách 1 100 96 97,7 63 64,3 2 100 98 64 3 100 99 66
Thùy lá non 1 100 94 94,7 56 57,7 2 100 95 58 3 100 95 59
Kết quả thu được (bảng 5) cho thấy, khi nuôi cấy cả 2 loại vật liệu là chồi nách và thùy lá non trong thời gian 2 tuần ở môi trường CIM chứa 12 mg/l picloram thì cả 2 loại vật liệu này đều đã cảm ứng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, chồi nách có thời gian cảm ứng nhanh hơn, sau 2 tuần hầu như các chồi đều đã cảm ứng tạo mô sẹo với tỷ lệ trung bình 97,7%, còn với mẫu thùy lá non thời gian cảm ứng tạo mô sẹo lâu hơn, sau 3 tuần các thùy lá mới cảm ứng tạo mô sẹo hoàn toàn với tỷ lệ tạo mô sẹo 94,7% thấp hơn không đáng kể so với tỷ lệ tạo mô sẹo bằng chồi nách.
Ở giai đoạn này, tất cả các khối mô sẹo khá giống nhau về màu sắc, tất cả đều có màu vàng nhạt và có độ nhày cao. Các cụm mô sẹo hình thành từ chồi nách rời rạc hơn và dễ dàng tách thành từng cụm nhỏ còn các cụm mô sẹo hình thành từ thùy lá non thì phần lớn tạo thành một khối chặt khó tách nhỏ hơn (hình 13)
Sau 2-3 tuần tạo mô sẹo trong môi trường CIM, các khối mô sẹo sẽ được loại bỏ hết dịch nhày và chuyển sang môi trường DKW nuôi cấy trong 2 tuần để chọn lọc các cụm mô sẹo có chất lượng tốt.
Kết quả thu được sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường DKW cho thấy tất cả các cụm mô sẹo đều phát triển tốt, có màu vàng tươi và bắt đầu có sự phân hóa thành các dạng phôi khác nhau. Các cụm mô sẹo hình thành từ các mô khác nhau có sự phân hóa khác nhau. Các cụm hình thành từ chồi nách có tỷ lệ phôi hình tim và hình thủy lôi cao hơn, các cụm hình thành từ thùy lá non có ít phôi hình tim, phần lớn là phôi hình thủy lôi và hình lá mầm. Điều này là do các tế bào từ thùy lá non đã phân hóa nên khả năng phản biệt hóa trở về dạng phôi hình cầu chậm hơn và tạo ra nhiều phôi hình lá mầm hơn các tế bào ở chồi nách.
Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường DKW các cụm mô sẹo tiếp tục được loại bỏ dịch nhày và chuyển sang môi trường MMS có chứa 12 mg/l picloram để tạo FEC. Cứ
2 tuần/lần chuyển các cụm mô sẹo sang môi trường MMS mới. Các cụm FEC từ nguồn vật liệu chồi nách đã bắt đầu xuất hiện sau 2-3 tuần nuôi cấy trên môi trường MMS. Với nguồn vật liệu là thùy lá non thì sau 4-5 tuần mới bắt đầu xuất hiện các cụm FEC, chậm hơn vật liệu chồi nách 1-2 tuần. Đồng thời, tỷ lệ trung bình chồi nách tạo FEC là 64,3% cao hơn đáng kể so với 57,7% tỷ lệ các thùy lá tạo FEC. Các cụm FEC này đều có màu vàng tươi, tròn như trứng cá, rời rạc và hầu như không có dịch nhày. Khi chuyển sang môi trường MMS mới các cụm FEC tiếp tục nhân lên tạo ra các quần thể tế bào khá đồng nhất về mặt hình dạng và kích thước.
Như vậy, trong thí nghiệm này sử dụng chồi nách của giống sắn TMS 60444
làm nguyên liệu tạo FEC mang lại hiệu quả tốt hơn do thời gian cảm ứng tạo mô sẹo và FEC nhanh hơn, đồng thời tỷ lệ tạo FEC cũng cao hơn khi sử dụng thùy lá non. Do đó, chúng tôi lựa chọn chồi nách để tạo FEC cho các thí nghiệm biến nạp tiếp theo
Hình 13: Cụm mô sẹo giống sắn TMS 60444 hình thành và phát triển trên các môi trường từ các nguồn vật liệu khác nhau. A, B: Cụm mô sẹo hình thành trên môi trường CIM; C, D: Cụm mô sẹo phát triển trên môi trường DKW.
Hình 14: Các khối FEC của TMS 60444 hình thành và phát triển trên môi trường MMS; A, C. Cụm FEC bắt đầu hình thành trên môi trường MMS. B, D. Các cụm FEC đang phát
triển bình thường trên môi trường MMS
3.2. Kết quả chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444
Trước đây, việc nhiễm Agrobacterium đã được thực hiện bằng cách nhỏ trực tiếp dịch treo lỏng Agrobacterium vào các cụm FEC trên môi trường rắn [19]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, việc nhiễm Agrobacterium đã được sửa đổi bằng cách ngâm FEC trong dịch treo tế bào Agrobacterium trong 2-4 phút ở nhiệt độ phòng. Điều này cho phép Agrobacterium tiếp xúc hiệu quả cho quá trình lây nhiễm tiếp theo trên tế bào FEC tương tự như báo cáo của Nyaboga và cs (2013) và trong các cây trồng khác như chuối [70].
Khả năng chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc khá nhiều vào đối tượng cây trồng và nguồn mẫu lây nhiễm. Một số cây trồng, đã sản sinh ra phytoxic trong quá trình sinh trưởng, chất này có khả năng ức chế rất mạnh sự sinh trưởng đối với vi khuẩn [37]. Khi được đồng nuôi cấy với FEC của sắn, sự sinh trưởng của vi khuẩn A. tumefaciens là khá mạnh và không phụ thuộc vào phương pháp lây nhiễm. Rõ ràng, trên đối tượng này, vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng sinh trưởng và
phát triển. Đây là một thuận lợi cho quá trình lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh trong quá trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn lọc sau này sẽ rất khó khăn để loại bỏ được chính vi khuẩn này. Sau khi đồng nuôi cấy các vi khuẩn nên được loại bỏ để dừng quá trình chuyển gen nếu không các mô sẹo sẽ bị chết [23]. Vì vậy, cần xác định được mật độ khuẩn thích hợp cho chuyển gen và nồng độ kháng sinh thích hợp cho việc loại khuẩn thừa sau biến nạp.
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444
Các thí nghiệm với các loại mẫu cấy khác nhau của cây sắn cho thấy nồng độ vi khuẩn cao có thể làm gia tăng sự biểu hiện tạm thời gen chỉ thị nhưng lại không tương quan với hiệu suất biến nạp. Nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn nồng độ vi khuẩn tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của mô. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn cao là rất cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm trong thời gian ngắn, rửa lại nhẹ nhàng với môi trường vô trùng hay thêm vào môi trường các tác nhân sát khuẩn [88].
Để tìm ra nồng độ khuẩn thích hợp nhất sử dụng cho biến nạp gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444, chúng tôi đã thử nghiệm khả năng kháng hygromycin của cụm FEC ở các giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7. Thực hiện 3 lần lặp lại thí nghiệm và ghi nhận kết quả (hình 15). Sai số giữa các lần thí nghiệm được tính bằng hàm STDEV trên excel.
Kết quả thu được trên hình 15 cho thấy, mật độ dịch khuẩn có ảnh hưởng khác nhau đáng kể giữa OD600 = 0,25 và 0,5 nhưng không có sự khác nhau đáng kể giữa OD600 = 0,5 và 0,7. Tại OD600 = 0,25 cho tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin trên môi trường chọn lọc thấp nhất (Dof1: 12,9% và p1303: 11,6%) chỉ bằng một nửa so với các mật độ khuẩn OD600 = 0,5 (Dof1: 24,7% và p1303: 24,2%) và OD600 = 0,7 (Dof1: 25,1% và p1303: 25,8%) tổng số mô sẹo được thử nghiệm.
Hình 15: Ảnh hưởng của các mật độ dịch khuẩn khác nhau đến khả năng tiếp nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444. Các giá trị sai khác có ý nghĩa giữa 3 lần lặp lại thí nghiệm độc lập.
Để xác định mật độ Agrobacterium thấp nhất nhưng hiệu quả nhất phù hợp cho sự tái sinh của cây chuyển gen, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào Agrobacterium khác nhau đến tỷ lệ phôi tái sinh trên môi trường chọn lọc. Mặc dù tỷ lệ FEC kháng hygromycin cao nhất trong các nghiệm thức là 25,1% (Dof1) và 25,8% (p1303) tại OD600 = 0,7 nhưng tỷ lệ phôi tái sinh chồi kháng hygromycin tại OD600 = 0,7 với tỷ lệ 17,9 (Dof1) 18,2 (p1303) lại thấp hơn tại OD600 = 0.5 với tỷ lệ là 22,8 (Dof1) và 21,9 (p1303), đây có thể là do sự phát triển quá mức của vi khuẩn
Agrobacterium. Saini và cs (2007) báo cáo rằng nồng độ Agrobacterium cao hơn có thể dẫn đến gây phản ứng quá nhạy cảm của mẫu cấy [67]. Dựa vào tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin và tạo phôi trên môi trường chọn lọc, OD600 = 0.5 đã được chọn để chuyển gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 giúp cải thiện cả hiệu quả chuyển gen Dof1 và giảm thiểu sự phát triển quá mức của Agrobacterium trong nghiên cứu này. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đó về chuyển gen vào cây sắn [20], [56], [69], [85].
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444 tiếp nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444
Tích hợp T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào bộ gen mục tiêu là một quá trình phức tạp: cảm ứng gen vir tối đa được quan sát thấy ở khoảng 25-27oC, tuy nhiên không phải tất cả các chủng vi khuẩn đều ổn định ở nhiệt độ này, một số chủng
Agrobacterium lại có khả năng chuyển gen ổn định hơn ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng 18-20oC) và không ổn định ở nhiệt độ trên 28oC [33]. Một số báo cáo cho rằng chuyển gen thông qua Agrobacterium cần được tiến hành ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng 21oC) [27], [41], [65]. Dillen và cs (1997) cũng báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho chuyển gen phụ thuộc vào sự kết hợp của chủng Agrobacterium và vật liệu thực vật. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen
Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444, trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành đồng nuôi cấy ở bốn chế độ nhiệt khác nhau: 20 oC, 22 oC, 24 oC, 26oC. Theo dõi khả năng kháng hygromycin của các cụm FEC trên môi trường chọn lọc sau 4 tuần đồng nuôi cấy và khả năng tái sinh của các cụm FEC này sau 8 tuần với 3 lần lặp lại, kết quả được ghi lại trên hình 16 như sau:
Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả năng tiếp nhận gen
Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của bốn chế độ nhiệt ở trên cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tiếp nhận gen Dof1 của các FEC giống sắn TMS 60444 (hình 16).
Kết quả theo dõi sau 4 tuần cho thấy khi đồng nuôi cấy ở 22oC cho tỷ lệ các cụm FEC kháng hygromycin là 32,5% (Dof1), 31,9% (p1303) cao hơn đáng kể so với khi đồng nuôi cấy ở 20oC (11,7% (Dof1), 11,5% (p1303)) và ở 26oC (21,4% (Dof1), 22% (p1303)) nhưng không cao hơn đáng kể so với khi đồng nuôi cấy ở 24oC (30,2% (Dof1), 30,7% (p1303)).
Để xác định được nhiệt độ đồng nuôi cấy phù hợp nhất cho chuyển gen Dof1 và tái sinh của cây chuyển gen, chúng tôi tiếp tục theo dõi khả năng tái sinh của các cụm FEC sau 8 tuần, kết quả cho thấy mặc dù các cụm FEC đồng nuôi cấy ở 22oC cho tỷ lệ sống sót của các cụm FEC sau 4 tuần là cao nhất so với các nghiệm thức nghiên cứu và cao hơn ở điều kiện 24oC nhưng tỷ lệ tái sinh của FEC ở 22oC là 12,4% (Dof1), 12,6% (p1303) thấp hơn đáng kể so với các cụm FEC đồng nuôi cấy ở 24oC với tỷ lệ tái sinh 24,8% (Dof1), 24,3% (p1303). Điều này là do khi đồng nuôi cấy ở nhiệt độ thấp (22oC) đã kìm hãm khả năng tái sinh của các cụm FEC sau đồng nuôi cấy và ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo cây chuyển gen Dof1. Kết quả nghiên cứu này tương tự như kết quả của Bull và cs (2009) nhưng cao hơn 1-2oC so với một vài nghiên cứu khác [56], [69], [71], [83].
Dựa vào tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin và tạo phôi trên môi trường chọn lọc, chế độ nhiệt 24oC đã được chọn làm điều kiện đồng nuôi cấy cho chuyển gen Dof1
vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 ở các thí nghiệm tiếp theo giúp cải thiện hiệu quả chuyển gen Dof1 và tái sinh cây hoàn chỉnh trong nghiên cứu này.
3.2.3. Kết quả nghiên cứu hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen
Trong quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, các vi khuẩn này có thể gây ra những sự bất lợi cho FEC trong suốt quá trình đồng nuôi cấy vì vậy cần thiết phải loại bỏ triệt để các vi khuẩn sau đó phục hồi FEC cho các giai đoạn sau [20]. Việc bổ sung kháng sinh khi tiến hành diệt vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả năng tái sinh [37].
Để loại hoàn toàn vi khuẩn Agrobacterium dư thừa sau 4 ngày đồng nuôi cấy cần có một nồng độ cefotaxime vừa có khả năng diệt khuẩn vừa đảm bảo được sức sống của mô. Việc lựa chọn được nồng độ kháng sinh thích hợp và xác định ảnh hưởng của kháng sinh đến khả năng tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen là rất quan trọng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ kháng sinh cefotaxime khác nhau đến khả năng loại khuẩn thừa và tiếp nhận gen Dof1 của giống sắn TMS 60444. Các FEC sau khi đồng nuôi cấy sẽ được rửa trong môi trường MMS lỏng có chứa kháng sinh cefotaxime ở dải nồng độ: 0 mg/l, 300 mg/l, 400 mg/l, 500 mg/l, 600 mg/l, 700mg/l, cho đến khi dịch trong, sau đó chuyển sang giấy thấm trên môi trường MMS rắn có chứa cefotaxime ở nồng độ tương ứng để nuôi phục hồi và