Các cây sắn TMS 60444 in vitro cao khoảng 5-6 cm được sử dụng để làm vật liệu tạo mô sẹo phôi hóa theo 2 phương pháp:
- Phương pháp 1 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng chồi nách): Các cây con được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày, tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi
trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang môi trường MMS có chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mô sẹo và tạo mô sẹo phôi hóa. Mô sẹo phôi hóa được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối [8].
- Phương pháp 2 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng thùy lá non): Các cây con 4-8 tuần tuổi sẽ được soi dưới kính hiển vi quang học để chọn ra các thùy lá ngọn còn non, chưa mở, dài khoảng 0,5-1 cm. Tách từng thùy lá non được chọn cho vào môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Sau 2-4 tuần thu được mô sẹo tiến hành các bước tiếp theo giống phương pháp 1.
Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:
Bả ng 3: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn
Giai đoạn Môi trường Hormone Thời gian
Chu kì sáng:tối (nhiệt độ) PP 1 PP 2
Tạo vật liệu khởi
đầu MS MS -
4-8
tuần 16h:8h (28°C) Tạo chồi nách CAM - BAP
10mg/L
2-4
ngày 0h:24h (28°C)
Tạo mô sẹo CIM CIM Picloram 12mg/L
2-4
tuần 0h:24h (28°C)
Chọn lọc mô sẹo DKW DKW Picloram 12mg/L
2-4
tuần 0h:24h (28°C)
Tạo và nhân mô sẹo phôi hóa
1/10MS (MMS) 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L 4–10 tuần 0h:24h (28°C)
Sự lựa chọn các thùy lá non, các cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mô sẹo phôi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.
Sự hình thành mô sẹo phôi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mô sẹo, màu sắc mô sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.
Tỷ lệ tạo mô sẹo được tính bằng số cụm mô sẹo trên số chồi ban đầu.
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa được tính bằng số cụm mô sẹo phôi hóa trên số chồi ban đầu.