nó đến khả năng sống sót và tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen
Trong quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, các vi khuẩn này có thể gây ra những sự bất lợi cho FEC trong suốt quá trình đồng nuôi cấy vì vậy cần thiết phải loại bỏ triệt để các vi khuẩn sau đó phục hồi FEC cho các giai đoạn sau [20]. Việc bổ sung kháng sinh khi tiến hành diệt vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả năng tái sinh [37].
Để loại hoàn toàn vi khuẩn Agrobacterium dư thừa sau 4 ngày đồng nuôi cấy cần có một nồng độ cefotaxime vừa có khả năng diệt khuẩn vừa đảm bảo được sức sống của mô. Việc lựa chọn được nồng độ kháng sinh thích hợp và xác định ảnh hưởng của kháng sinh đến khả năng tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen là rất quan trọng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ kháng sinh cefotaxime khác nhau đến khả năng loại khuẩn thừa và tiếp nhận gen Dof1 của giống sắn TMS 60444. Các FEC sau khi đồng nuôi cấy sẽ được rửa trong môi trường MMS lỏng có chứa kháng sinh cefotaxime ở dải nồng độ: 0 mg/l, 300 mg/l, 400 mg/l, 500 mg/l, 600 mg/l, 700mg/l, cho đến khi dịch trong, sau đó chuyển sang giấy thấm trên môi trường MMS rắn có chứa cefotaxime ở nồng độ tương ứng để nuôi phục hồi và loại khuẩn thừa. Việc sử dụng giấy thấm cho phép chuyển các FEC sang môi trường mới hàng tuần một cách dễ dàng, đồng thời kiểm soát chặt chẽ các thành phần môi trường cho sự phát triển của FEC như: pH, nồng độ muối và các vitamin, nồng độ chất kháng sinh.
Bả ng 6: Hiệu quả diệt khuẩn của cefotaxime và ảnh hưởng của nó đến tỉ lệ sống sót và khả năng tái sinh của FEC giống sắn TMS 60444 (sau 8 tuần) Nồng độ cefotaxime (mg/l) Lượng FEC/ lần biến nạp (mg) Tỷ lệ nhiễm khuẩn
lại (%) Tỷ lệ tạo chồi (%)
Thời gian bắt đầu
tạo chồi (ngày) Số lá/cụm (lá)
Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303 Dof1 P1303
0 200 200 100 100 0 0 0 0 0 0 300 200 200 20,2±0,06 20±0,06 66±0,06 65,7±0,12 25,2±0,06 25,3±0,1 3,5±0,06 3,2±0,06 400 200 200 8,5±0,06 8,6±0,06 68,9±0,06 68,5±0,06 26±0,15 26,3±0,1 3,5±0,1 3,1±0,15 500 200 200 5,8±0,06 5,6±0,1 25,1±0,1 24,6±0,06 27,1±0,1 27±0,06 2,3±0,1 2,1±0,06 600 200 200 0 0 15,2±0,06 14,5±0,06 30,1±0,1 30,3±0,06 1,7±0,06 1,5±0,1 700 200 200 0 0 3,6±0,06 3,4±0,06 28±0,06 28±0,12 2,2±0,06 2±0,06
Kết quả theo dõi sau 8 tuần (bảng 6) với 3 lần lặp lại thí nghiệm cho thấy, ở công thức đối chứng không bổ sung cefotaxime các FEC bị nhiễm khuẩn hoàn toàn không còn khả năng sống sót và tái sinh, tỉ lệ nhiễm khuẩn giảm dần khi tăng nồng độ cefotaxime ở các nghiệm thức nghiên cứu. Điều đó cho thấy ở nồng độ tương đối thấp kháng sinh cefotaxime không gây ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mô sẹo phôi hóa. Vì vậy có thể tiếp tục sử dụng kháng sinh này cho các bước chọn lọc tiếp theo.
Tuy không gây chết đối với mô sẹo phôi hóa nhưng kháng sinh cefotaxime ức chế khả năng tái sinh và ảnh hưởng đến thời gian tái sinh chồi từ FEC. Cụ thể, ở công thức đối chứng không bổ sung cefotaxime thì tỷ lệ FEC sau biến nạp bị nhiễm khuẩn lại là 100% do đó các FEC hoàn toàn không có khả năng tái sinh. Khi bổ sung chất kháng sinh cefotaxime ở nồng độ 300 - 700 mg/l các FEC đều có khả năng tái sinh. Tuy nhiên tỷ lệ tái sinh giảm dần khi tăng nồng độ cefotaxime. Điều này được thể hiện rõ qua các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển như: tỷ lệ tạo chồi, thời gian tạo chồi, màu sắc, số lá trên cụm... (bảng 6).
Cụ thể, khi bổ sung 300mg/l cefotaxime thì tỷ lệ nhiễm khuẩn lại giảm xuống còn khoảng 20% đồng thời tỷ lệ tạo chồi tương đối cao (65-66%). Bổ sung cefotaxime ở 400 mg/l cho tỷ lệ tạo chồi 68,7% (Dof1) và 68,5% (p1303) cao hơn không đáng kể nhưng tỷ lệ nhiễm khuẩn lại thấp hơn đáng kể (từ 8,5-8,6%) so với 300 mg/l cefotaxime thời gian bắt đầu tạo chồi ngắn và số lá trên cụm chồi nhiều (bảng 5). Tăng nồng độ cefotaxime lên 500mg/l thì tỷ lệ nhiễm khuẩn giảm gần như bằng 0% tuy nhiên tỷ lệ tạo chồi thấp hơn và thời gian tạo chồi dài hơn so với khi bổ sung các nồng độ 300mg/l và 400mg/l. Khi tăng nồng độ cefotaxime lên 600-700 mg/l thì tỷ lệ nhiễm khuẩn lại bằng 0% tuy nhiên tỷ lệ tái sinh rất thấp chỉ khoảng 3-15%. Như vậy sẽ rất khó thu được cây chuyển gen.
Như vậy nồng độ cefotaxime 400mg/l là nồng độ thích hợp nhất so với các nghiệm thức nghiên cứu để loại bỏ khuẩn trên cụm mô sẹo phôi hóa sau biến nạp, đồng thời không gây ức chế mạnh khả năng tái sinh của mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444. Kết quả này cao hơn kết quả nghiên cứu của Ubalua và Mbanaso (2013).