gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444
Các thí nghiệm với các loại mẫu cấy khác nhau của cây sắn cho thấy nồng độ vi khuẩn cao có thể làm gia tăng sự biểu hiện tạm thời gen chỉ thị nhưng lại không tương quan với hiệu suất biến nạp. Nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn nồng độ vi khuẩn tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của mô. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn cao là rất cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm trong thời gian ngắn, rửa lại nhẹ nhàng với môi trường vô trùng hay thêm vào môi trường các tác nhân sát khuẩn [88].
Để tìm ra nồng độ khuẩn thích hợp nhất sử dụng cho biến nạp gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444, chúng tôi đã thử nghiệm khả năng kháng hygromycin của cụm FEC ở các giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7. Thực hiện 3 lần lặp lại thí nghiệm và ghi nhận kết quả (hình 15). Sai số giữa các lần thí nghiệm được tính bằng hàm STDEV trên excel.
Kết quả thu được trên hình 15 cho thấy, mật độ dịch khuẩn có ảnh hưởng khác nhau đáng kể giữa OD600 = 0,25 và 0,5 nhưng không có sự khác nhau đáng kể giữa OD600 = 0,5 và 0,7. Tại OD600 = 0,25 cho tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin trên môi trường chọn lọc thấp nhất (Dof1: 12,9% và p1303: 11,6%) chỉ bằng một nửa so với các mật độ khuẩn OD600 = 0,5 (Dof1: 24,7% và p1303: 24,2%) và OD600 = 0,7 (Dof1: 25,1% và p1303: 25,8%) tổng số mô sẹo được thử nghiệm.
Hình 15: Ảnh hưởng của các mật độ dịch khuẩn khác nhau đến khả năng tiếp nhận gen Dof1 của FEC giống sắn TMS 60444. Các giá trị sai khác có ý nghĩa giữa 3 lần lặp lại thí nghiệm độc lập.
Để xác định mật độ Agrobacterium thấp nhất nhưng hiệu quả nhất phù hợp cho sự tái sinh của cây chuyển gen, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào Agrobacterium khác nhau đến tỷ lệ phôi tái sinh trên môi trường chọn lọc. Mặc dù tỷ lệ FEC kháng hygromycin cao nhất trong các nghiệm thức là 25,1% (Dof1) và 25,8% (p1303) tại OD600 = 0,7 nhưng tỷ lệ phôi tái sinh chồi kháng hygromycin tại OD600 = 0,7 với tỷ lệ 17,9 (Dof1) 18,2 (p1303) lại thấp hơn tại OD600 = 0.5 với tỷ lệ là 22,8 (Dof1) và 21,9 (p1303), đây có thể là do sự phát triển quá mức của vi khuẩn
Agrobacterium. Saini và cs (2007) báo cáo rằng nồng độ Agrobacterium cao hơn có thể dẫn đến gây phản ứng quá nhạy cảm của mẫu cấy [67]. Dựa vào tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin và tạo phôi trên môi trường chọn lọc, OD600 = 0.5 đã được chọn để chuyển gen Dof1 vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 giúp cải thiện cả hiệu quả chuyển gen Dof1 và giảm thiểu sự phát triển quá mức của Agrobacterium trong nghiên cứu này. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đó về chuyển gen vào cây sắn [20], [56], [69], [85].