Môi trường nuôi cấy
Các loại môi trường nuôi cấy mô sẹo được cải tiến dựa trên các loại môi trường có trong nghiên cứu của Zainuddin và cs (2012):
- Môi trường MS (môi trường nhân cây in vitro): 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v), 0,3% Gelrite (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CAM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 0,1% BAP (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CIM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v) , 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường DKW: Hỗn hợp muối bazo và vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường MMS (1/10MS) có bổ sung 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), 12 mg/l picloram và vitamin, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường MSN (môi trường tái sinh phôi tạo cây hoàn chỉnh): 1× muối MS và các vitamin, 1mg/l NAA, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CEM (môi trường tạo rễ): 1× muối MS và các vitamin, 2 μM CuSO4, 0,4 mg/l BAP, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường YEB đặc (yeast extract broth) dùng để chọn lọc Agrobacterium: 1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone, 5 g/l sucrose, 1,5% BactoTM agar (w/v), pH 7,2, khử trùng.
- Môi trường YEB lỏng (yeast extract broth) dùng để nuôi cấy Agrobacterium: 1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone, 5 g/l sucrose, pH 7,2, khử trùng. Bổ sung dung dịch MgSO4 vô trùng để đạt nồng độ cuối cùng 2 mM.
Các hóa chất khác
- Kháng sinh chọn lọc khuẩn: dung dịch kanamycin 50 mg/l. - Kháng sinh diệt khuẩn: dung dịch cefotaxime 200 mg/mL.
- Chất chọn lọc thực vật chuyển gen: dung dịch hygromycin 25mg/mL. - Dung dịch acetosyringone 200 mM.
Vật tư tiêu hao
+ Đĩa petri vô trùng 90 mm; rây nhựa vô trùng cỡ 100 μm; pipet 25 mL vô trùng; lọ thủy tinh vô trùng; ống falcon vô trùng 15 mL và 50 mL; ống Eppendorf (1,5 mL); parafilm; đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 μm); giấy nhôm; giấy lọc vô trùng; xi-lanh (10 mL); các loại đầu côn vô trùng; chậu; cốc nhựa; bình phun sương.
Trang thiết bị
+ Nồi khử trùng; pH mét; cân điện tử chính xác; máy ly tâm; máy lắc; buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (28°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối cường độ ánh sáng 3000 lux); buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (24°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối cường độ ánh sáng 3000 lux); bốc cấy vô trùng với đèn cồn; tủ lạnh (4°C) và tủ âm sâu (−20°C); panh, dao, kéo, thìa xúc; que cấy; tủ lắc ổn nhiệt (28°C); quang phổ kế; cu-vét 1 mL; thanh khuấy từ; máy vortex; micropipette; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh.