Hygromycin B là một kháng sinh aminoglycoside không điển hình với cấu trúc và chức năng độc đáo [52]. Trong phòng thí nghiệm nó được sử dụng cho chọn lọc và lưu giữ các tế bào prokaryotic và eukaryotic chứa gen kháng hygromycin. Gen kháng hygromycin thường được sử dụng như một marker chọn lọc trong nghiên cứu trên thực vật. Gen kháng là một kinase ức chế hoạt động của hygromycin B thông qua phosphoryl [60].
Phát triển cây trồng chuyển gen mang các gen quan tâm cho phép chúng ta đi sâu nghiên cứu chức năng của gen. Vì vậy cần xác định được ngưỡng có tác dụng gây chết 100% của chất chọn lọc hygromycin lên FEC chưa chuyển gen của giống sắn
TMS 60444 để phục vụ cho chọn lọc các mô đã chuyển gen sau này. Các FEC sau đồng nuôi cấy và được loại khuẩn thừa sẽ được chuyển sang môi trường MMS có bổ sung 400 mg/l cefotaxime và kháng sinh hygromycin ở các nồng độ tăng dần từ 0 mg/l; 5 mg/l; 10 mg/l; 15 mg/l; 20 mg/l; 25 mg/l. Theo dõi hiệu quả gây chết của hygromycin ở các nồng độ sau thời gian 8 tuần với 3 lần lặp lại, kết quả thu được thể hiện trong hình 17.
Hình 17: Hiệu quả gây chết của hygromycin lên FEC của giống sắn TMS 60444
Kết quả sau 8 tuần chọn lọc trong môi trường MMS chứa hygromycin ở các nồng độ khác nhau (hình 18) cho thấy, ở môi trường đối chứng không bổ sung hygromycin, các cụm FEC không chết mà vẫn tiếp tục nhân lên. Với các môi trường có bổ sung hygromycin nồng độ 5, 10, 15, 20 mg/l, sau 8 tuần nuôi cấy, các cụm FEC chết và giảm dần về số lượng tùy từng nồng độ hygromycin.
Ở nồng độ 5 mg/l và 10 mg/l hygromycin, sau 8 tuần chọn lọc số cụm FEC sống vẫn còn nhiều tương ứng là 19,3 cụm và 9,7 cụm. Như vậy nồng độ này là chưa đủ nên cho hiệu quả chọn lọc chưa cao. Còn ở nồng độ 25 mg/l các cụm FEC chết rất nhanh và đen dần, chỉ sau 4 tuần nuôi cấy các cụm FEC đã chết gần như hoàn toàn chỉ còn 2,7 cụm sống sót sang đến tuần thứ 5 và đến tuần thứ 6 thì không còn cụm nào sống sót trên môi trường này. Như vậy, nồng độ này là quá cao cho chọn lọc FEC của sắn, khi chọn lọc ở nồng độ này các cụm FEC yếu sẽ nhanh chóng bị giết chết mà các cụm này có thể mang gen chuyển. Với nồng độ 15 mg/l hygromycin cho hiệu quả tương đối tốt, các cụm FEC chết dần dần qua các tuần, vì vậy có thể đảm bảo thời gian hồi phục cho các cụm FEC yếu mang gen chuyển sau thời gian đồng nuôi cấy sau này. Tuy nhiên, sau 8 tuần chọn lọc vẫn còn một vài cụm FEC sống sót, do đó việc chọn lọc sẽ mất nhiều thời gian và chưa thể chọn lọc triệt để các mô chưa chuyển gen. Với nồng độ 20 mg/l hygromycin các cụm FEC chuyển màu vàng đậm, khô dần và chết trong thời gian nuôi cấy, do đó, các cụm yếu sẽ có thời gian để hồi phục. Sau 6 tuần các cụm gần như chết hoàn toàn, sang đến tuần thứ 8 thì ở nồng độ 20 mg/l các cụm FEC đã chết hoàn toàn. Kết quả này cao hơn ở trong các nghiên cứu trước đó [20], [56]. Tuy nhiên, chọn lọc ở nồng độ này sẽ rút ngắn được thời gian và chọn lọc triệt để hơn các cụm chưa chuyển gen so với nồng độ 15 mg/l hygromycin. Như vậy, ở trong thí nghiệm này, bổ sung nồng độ 20 mg/l hygromycin là thích hợp nhất cho việc chọn lọc các dòng chuyển gen sau này.
Hình 18: Các cụm FEC trong môi trường MMS bổ sung hygromycin ở các nồng độ khác nhau sau 8 tuần chọn lọc (mũi tên chỉ cụm FEC còn sống); A. 0 mg/l hygromycin; B. 5 mg/l hygromycin; C. 10 mg/l hygromycin; D. 15 mg/l hygromycin; E. 20 mg/l hygromycin; F. 25 mg/l hygromycin.
Nguyên nhân là do trong bộ gen của các cụm FEC chưa chuyển gen không chứa gen kháng hygromycin, nên khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin ở nồng độ thích hợp thì các cụm FEC không có khả năng kháng lại và sẽ yếu dần rồi chết. Trong khi đó, các cụm FEC được chuyển gen sẽ mang một đoạn gen kháng hygromycin, do đó chúng có khả năng sống sót, nhân lên và tái sinh trong môi trường chứa hygromycin.Quá trình thử FEC ở các nồng độ khác nhau giúp chọn ra được nồng độ hygromycin thích hợp nhất cho việc chọn lọc các cụm FEC sau chuyển gen: nồng độ hygromycin phải vừa đủ để làm cho các cụm FEC không chuyển gen chết hoàn toàn, và cũng không được quá lớn vì sẽ ức chế khả năng phát triển tốt của cả các cụm FEC đã mang gen chuyển.