Theo dõi sự phát triển của các cây chuyển gen Dof1 trồng trong điều kiện nhà lưới, sau 3 tháng tiến hành quan sát và đánh giá các đặc điểm hình thái cây chuyển gen Dof1 so với cây đối chứng theo phương pháp đánh giá của Fukuda và cs (2010) và ghi lại kết quả theo bảng 9 và hình 25 như sau:
Bả ng 9: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 3 tháng trồng trong nhà lưới
Các chỉ tiêu đánh giá Dof1 ĐC
Màu lá ngọn Xanh nhạt Xanh tía
Lông lá ngọn Có Có
Màu cuống Xanh Xanh phớt đỏ Cao cây (cm) 50,6 ± 1,7 72,4 ± 1,9
Số thùy lá 5 7
Hình 25: Cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 3 tháng trồng trong nhà lưới. A, B. Hình dạng và màu sắc lá; C, D. Màu sắc lá ngọn; E, F. Màu sắc thân, cuống
Qua quan sát và đánh giá các cây con 3 tháng tuổi trong nhà lưới, chúng tôi nhận thấy, tất cả các cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng đều phát triển tốt, thân và lá xanh, đều có lông ở lá ngọn và đều có 5 thùy lá. Tuy nhiên, các cây chuyển gen
Dof1 có một số khác biệt cơ bản về hình thái so với cây đối chứng như: màu sắc lá ngọn, màu sắc lá và cuống lá, hình dạng lá, chiều cao cây.
Cụ thể, về màu sắc, các cây chuyển gen Dof1 có lá ngọn màu xanh nhạt, thân và lá có màu xanh đậm, cuống lá hướng lên và có màu xanh, khác hoàn toàn so với đối chứng với lá ngọn xanh tía, thân và lá xanh nhạt, cuống lá hướng ngang và có màu xanh phớt đỏ.
Về chiều cao cây, sau khi quan sát và đo chiều cao cây, chúng tôi thấy sau 3 tháng trồng trong nhà lưới các cây chuyển gen Dof1 có chiều cao trung bình (50,6 cm) thấp hơn đáng kể so với các cây đối chứng (72,4 cm), đồng thời các đốt thân của cây chuyển gen cũng dày hơn so với cây đối chứng. Những khác biệt này có thể sẽ là những tính trạng có lợi của cây chuyển gen sau này giúp giảm chiều cao cây so với cây đối chứng.
Đặc biệt, tất cả các cây chuyển gen Dof1 đồng loạt có mép lá cong rủ, cụp xuống dưới trong khi các cây đối chứng có mép lá phẳng. Điều này có thể là do sự siêu biểu hiện của promoter 35S trong cây chuyển gen đã làm cho cây biểu hiện kiểu hình khác cây đối chứng. Cần tiếp tục theo dõi thêm sự biểu hiện kiểu hình của các cây chuyển gen để đánh giá.
Như vậy, sau 3 tháng trồng ra nhà lưới, các cây chuyển gen Dof1 đã có biểu hiện một vài sự khác biệt rất rõ ràng so với cây đối chứng về cả màu sắc, hình dạng, số thùy lá và chiều cao cây.
3.3.3. Kết quả đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 thế hệ T0 sau 6 tháng trồng ra nhà lưới. hệ T0 sau 6 tháng trồng ra nhà lưới.
Tiếp tục theo dõi và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen
Dof1 trong nhà lưới ở các giai đoạn khác nhau, kết quả đánh giá sau 6 tháng trồng được ghi lại trong bảng 10:
Bả ng 10: Bảng đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen Dof1 sau 6 tháng so với đối chứng trong điều kiện nhà lưới
Chỉ tiêu theo dõi Dof1 ĐC
Độ bền lá Kém Trung bình Dạng thùy lá giữa Ngọn giáo Mác elip
Màu cuống Xanh Xanh phớt đỏ Màu lá Xanh đậm Xanh nhạt
Số thùy lá 7 9
Viền lá Mượt Mượt
Màu gân lá Xanh Xanh phớt đỏ Hướng cuống Không đều Không đều Cao cây (cm) 123,7 ± 11,2 192,5 ± 8,9 Sự phân chạc Không phân chạc Phân chạc
Kiểu chạc Mọc thẳng đứng 2-4
Hoa Chưa có Chưa có
Kết quả theo dõi sau 6 tháng trồng trong nhà lưới thể hiện trong bảng 10, hình 26 và hình 27 cho thấy các cây chuyển gen Dof1 và cây đối chứng đều phát triển khá tốt, các cây đều chưa có hoa, viền lá mượt, hướng cuống không đều. Tất cả các cây chuyển gen Dof1 phát triển khá đồng đều nhau cả về hình thái cũng như sự phát triển và có sự khác biệt đáng kể so với đối chứng về nhiều đặc điểm như: màu sắc, hình dạng, chiều cao, số lượng thùy lá và sự phân chạc.
Đa số các cây mang gen Dof1 có thân, lá ngọn, gân lá và cuống lá đều có màu xanh nhạt, lá trưởng thành có màu xanh đậm, lá giữa có dạng hình ngọn giáo. Trong khi tất cả các cây đối chứng có thân và lá trưởng thành màu xanh nhạt còn lá ngọn và
cuống lá có màu xanh phớt đỏ, lá giữa có dạng hình mác elip. Tuy nhiên khả năng giữ lá của các cây chuyển gen Dof1 kém hơn các cây đối chứng.
Ở giai đoạn này, các cây chuyển gen Dof1 và các cây đối chứng đã có sự chênh lệch đáng kể về chiều cao cây trung bình so với giai đoạn 3 tháng tuổi, các cây chuyển gen Dof1 có chiều cao trung bình (123,7 cm) thấp hơn so với cây đối chứng (192,5 cm), đồng thời các cây chuyển gen Dof1 có kiểu hình mọc thẳng không phân chạc trong khi các cây đối chứng hầu hết có sự phân chạc từ 2-4 chạc, tán xòe rộng dẫn đến tốn nhiều diện tích trồng sắn hơn các cây chuyển gen Dof1. Có thể thấy, đây là một tính trạng có lợi của cây chuyển gen Dof1 giúp tiết kiệm diện tích, tăng mật độ trồng sắn, và có tiềm năng mang lại năng suất tốt hơn trên một đơn vị diện tích canh tác so với đối chứng.
Như vậy, sau 6 tháng trồng trong nhà lưới, các cây chuyển gen Dof1 đều đã thích ứng được với điều kiện khí hậu của vùng và phát triển rất tốt, thể hiện nhiều đặc điểm khác biệt và có lợi hơn so với các cây đối chứng. Các cây này sẽ được theo dõi và đánh giá tiếp trong các giai đoạn 9 tháng và khi thu hoạch để phát hiện thêm các đặc điểm có lợi của cây chuyển gen Dof1 so với cây đối chứng.
Hình 26: Các cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 và cây đối chứng sau 6 tháng trồng trong nhà lưới.
Hình 27: Một số hình ảnh về sự phân chạc của cây đối chứng (vòng tròn đỏ biểu thị vị trí phân chạc).
KẾT LUẬN
1. Tạo thành công FEC giống sắn TMS 60444, chồi nách của giống sắn TMS 60444
cho hiệu quả tạo FEC cao hơn và hết ít thời gian hơn thùy lá non.
2. Mật độ khuẩn OD600 = 0,5 là thích hợp cho chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn
TMS 60444; nồng độ 400 mg/l cefotaxime thích hợp cho loại khuẩn thừa sau biến nạp; nồng độ 20 mg/l hygromycine là ngưỡng gây chết 100% đối với FEC giống sắn
TMS 60444 được dùng để chọn lọc cây chuyển gen Dof1.
3. Qua nghiên cứu chuyển gen chúng tôi đã tạo thành công 18 dòng cây sắn chuyển gen Dof1 và đưa các dòng cây sắn chuyển gen Dof1 thế hệ T0 ra trồng tại nhà lưới. 4. Cây chuyển gen Dof1 có các đặc tính nông sinh học khác với cây đối chứng: lá ngọn màu xanh nhạt, lá màu xanh đậm, xẻ 5-7 thùy, thùy lá trung tâm có dạng hình ngọn giáo, gân lá và cuống lá màu xanh khác với cây đối chứng có lá ngọn màu xanh tía, lá màu xanh nhạt, xẻ 7-9 thùy, thùy lá trung tâm có dạng hình mác elip, gân lá và cuống lá có màu xanh phớt đỏ.
KIẾN NGHỊ
- Tiến hành các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử (southern blot, northern blot…) để kiểm tra các cây chuyển gen
- Tiếp tục theo dõi và đánh giá các đặc tính nông sinh học của cây chuyển gen
- Tiến hành các thí nghiệm hóa sinh phân tích hàm lượng protein, axit amin trong cây chuyển gen Dof1 so với cây đối chứng không chuyển gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008), “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”, Tạp chí phát triển KH&CN, 11(1), tr. 90-95.
2. Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2005), Tinh bột sắn và các sản phẩm từ tinh bột sắn,Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật.
3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng-Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp. 4. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005),
Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp I.
5. Nguyễn Thị Hòa Vân (2009), Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAc vào cây hoa đồng tiền, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nông nghiệp.
6. Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Hưng Quang (2011), Hiện trạng sử dụng sắn và phụ phẩm từ sắn trong chăn nuôi gia súc nhai lại tại Việt Nam, Tạp chí Khoa học và công nghệ, 82(06): 59 – 63.
7. Nguyễn Văn Đồng và Lê Thị Thủy (2013), Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong việc nhân nhanh một số giống sắn sạch bệnh, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 5/2013.
8. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Tiến Dũng, Tống Thị Hường, Lê Thị Ngọc Quỳnh, Lê Thị Lý, Vũ Anh Thu, Vũ Hoàng Nam, Vũ Thế Hà, Lê Huy Hàm, Chikako Utsumi, Yoshinori Utsumi, Motoaki Seki (2014), Kết quả tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ cho chuyển gien vào cây sắn, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 8(1):29-35, 2014; Đính chính: Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 9(2):147–148, 2015.
9. Phạm Văn Biên và Hoàng Kim (1995), Cây sắn, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
10. Quách Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Đức Doanh, Nhữ Viết Cường, Hoàng Thị Ngát, Lê Thị Ánh Hồng (2006), Một số kết quả về chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20, 41-44.
11. Tổng cục thống kê (2014), Niên giám thống kê, NXB Thống kê.
12. Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình cây sắn, NXB Nông nghiệpHà Nội.
13. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), Đại học Huế.
14. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công nghệ gen trong Nông nghiệp, Đại học Huế.
15. Trần Văn Minh (2003), Công nghệ sinh học thực vật, Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
16. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập 4 – Công nghệ sinh học di truyền,
Nxb Giáo Dục.
Tài liệu tiếng Anh
17. Abrahamian P. and Kantharajah A. (2011), "Effect of Vitamins on In Vitro
Organogenesis of Plant", American Journal of Plant Sciences, 2, pp. 669-674. 18. Allem, A.C. (2002), "The Origins and Taxonomy of Cassava", in Cassava:
Biology, Production and Utilization, (Eds). R.J. Hillocks, J.M. Thresh, and A.C. Bellotti. CABI Publishing: New York, USA, pp. 1-16.
19. Baba A. I., Nogueira F. C. S., Pinheiro C. B., Brasil J. N., Jereissati E. S., Jucá T. L., Soares A. A., Santos M. F., Domont G. B. And Campos F. A. P. (2008), Proteome analysis of secondary somatic embryogenesis in cassava (Manihot esculenta), Plant Sci., 175, 717–723. doi: 10.1016/j.plantsci.2008.07.014.
20. Bull S. E., Owiti J. A., Niklaus M., Beeching J. R., Gruissem W. and Vanderschuren H. (2009). Agrobacterium-mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava, Nat. Protoc., 4, 1845–1854. doi: 10.1038/nprot.2009.208.
21. Ceballos H., Iglesias C. A., Perez J. C. and Dixon A. G. O. (2004), Cassava breeding: opportunities and challenges, Plant Mol. Biol., 56: 503-16; PMID: 15630615; http:// dx.doi.org/10.1007/ s11103-004-5010-5.
22. Ceballos H. and G. de la Cruz (2012), "Cassava Taxonomy and Morphology", in Ospina B. and Ceballos H. (Eds), Cassava in the Third Millenium: Modern Production, Processing, Use and Market System,. CIAT. Vol. 377, CIAT Publication: Colombia, pp. 15-28.
23. Cheng M., Brenda A. L., Spencer T. M., Xudong Ye and Charles L. Armstrong. (2004), Invited review: Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 40: 31–45.
24. Cock J. H. (1982), Cassava: a basic energy source in the tropics, Science, 218, 755–762.
25. Coruzzi G. M. & Zhou L. (2001), Carbon and nitrogen sensing and signaling in plants: emerging ‘matrix effects’, Curr. Opin. Plant Biol. 4, 247-253.
26. Dai D., Hu Z., Pu G., Li H., Wang C. (2006), Energy efficiency and potentials of cassava fuel ethanol in Guangxi region of China, Energy Convers Manage 47: 1686–1699.
27. Dillen W., De Clercq J., Kapila J., Zambre M., Van Montagu M., Angenon G. (1997), The effect of temperature on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer to plants, Plant J., 12:1459–1463
28. EE S. F., Khairunnisa M. B., Zeti-Azura M. H., Noor Azmi S. and Zamri Z. (2014), Effective hygromycin concentration for selection of Agrobacterium- mediated transgenic Arabidopsis thaliana, Malaysian Applied Biology, 43 (1). pp. 119-123, ISSN 0126-8643.
29. Fauquet C. M. (2008), Cassava: A Gift to the World and a Challenge for Scientists. Paper presented at “Cassava meeting the challenges of the new millennium” hosted by IPBO- Ghent University, Belgium, 21-25.
30. Foyer, C. H. & Ferrario, S. (1994), Modulation of carbon and nitrogen metabolism in transgenic plants with a view to improved biomass production, Biochem. Soc. Trans., 22 , 909-915.
31. Fukuda W. M. G., Guevara C. L., Kawuki R. and Ferguson M. E. (2010), Selected morphological and agronomic descriptors for the characterization of cassava,
International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria, 19pp. 32. Gallardo F., Fu J., Canton F. R., Garcia-Gutierrez A., Canovas F. M. & Kirby E.
G. (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar, Planta, 210, 19-26.
33. Gelvin S. B. (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the ‘‘gene-jockeying’’ tool, Microbiol Mol BiolRev, 67:16–37.
34. Gilberston R. L.; Rojas M.R.; Russell D.; Maxwell D. P. (1991), The use of the asymmetric polymerase chain reaction and DNA sequencing to determinate genetic variability among isolates of bean golden mosaic geminivirus in the Dominican Republic, J. Gen. Virol., 72: 2843-2848.
35. González A. E., Schöpke C., Beachy N. R. N., MIFauquet C. (1998), Regeneration of transgenic plants (Manihot esculenta. Crantz) through Agrobacterium mediated transformation of embryogenic suspension cultures,
Plant Cell Rep, 17: 827–831.
36. Hoang Kim, Le Huy Ham, Manabu Ishitani, Hernan Ceballos, Nguyen Van Bo, Tran Ngoc Ngoan, Kazuo Kawano, Reinhardt Howeler, Rod Lefroy, Nguyen Phuong, Hoang Long, Nguyen Thi Le Dung, Tran Cong Khanh, Vo Van Quang, Dao Trong Tuan, Nguyen Minh Cuong, Nguyen Van Vu and Nguyen Van Dong (2013). Vietnam cassava breeding overview: the broad perspective. Presentation to Kickoff Meeting of a Cooperative Research Project under the East Asia Joint Research Program (e-ASIA JRP) at AGI, Hanoi on Jan.8 and 9, 2013.
37. Hoshi Y., Kondo M., Mori S., Adachi Y., Nakano M. and Kobayashi H. (2004), "Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated transformation", Plant Cell Rep, 22 (6), pp. 359-364.
38. Howeler R. và Aye T. M. (2015), Sustainable management of cassava in Asia – From research to practice, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), 396, 148p.
39. Ihemere U., Arias-Garzon D., Lawrence S. and Sayre R. (2006), Genetic modification of cassava for enhanced starch production, Plant Biotechnology Journal, 4, pp. 453–465.
40. Jaglo-Ottosen K. R., Gilmour S. J., Zarka D. G., Schabenberger O. & Thomashow M. F. (1998), Arabidopsis CBF1 overexpression inducees COR genes and enhances freezing tolerance, Science, 280, 104-106. 41. Jin S. X., Zhang X. L., Liang S. G., Nie Y. C., Guo X. P., Huang C. (2005),
Factors affecting transformation efficiency of embryogenic callus of Upland cotton (Gossypium hirsutum) with Agrobacterium tumefaciens, Plant Cell Tissue Organ Cult, 81:229-237.
42. Joseph R., Yeoh H.-H. and C.-S. (2004), Loh Induced mutations in cassava using somatic embryos and the identification of mutant plants with altered starch yield and composition. Plant Cell Reports 23(1-2): 91-98.
43. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. & Shinozaki K. (1998), Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat. Biotechnol. 17, 287-291.
44. Katagiri F., and Chua N. H. (1992), Plant transcription factors: Present knowledge and future challenges, Trends Genet, 8, 22–27.
45. Koehorst-van Putten H. J. J., Sudarmonowati E., Herman M., Pereira-Bertram I. J., Wolters A. M. A., Meima H., Vetten N., Raemakers C. J. J. M., and Visser R.