Việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất sắn đang được triển khai rộng rãi. Tuy nhiên, lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản
xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú là rất cần thiết [68].
Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn theo cách này là cần thiết. Sau một thời gian phát triển công nghệ trong những năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng. Mọi nỗ lực hướng vào tích hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại trong tương lai. Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [68].
Có rất nhiều công trình chuyển gen thành công trên các giống cây trồng như: đậu tương, ngô, lúa, bông, cà chua... nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có một công trình chuyển gen thành công nào ở sắn thông qua vi khuẩn
Agrobacterium được công bố mà chỉ có một công trình chuyển gen bằng phương pháp bắn gen được công bố của nhóm tác giả Bùi Lan Anh và cs [1].
Hiện nay, ở Việt Nam nghiên cứu tạo giống sắn biến đổi gen vẫn còn khá mới mẻ. Chỉ sau năm 2000, nước ta mới có một vài đề tài nghiên cứu đầu tiên về tạo giống sắn biến đổi gen: chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào cây sắn bằng A. tumefaciens [10], chuyển gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây sắn bằng súng bắn gen [1]…Tuy nhiên, các cây sắn biến đổi gen này vẫn chưa được mở rộng gieo trồng ở Việt Nam, mà mới trong phạm vi phòng thí nghiệm và trồng thử nghiệm.
Năm 2008, Bùi Lan Anh và cs đã nghiên cứu chuyển gen vào sắn nhưng nguyên liệu là mảnh lá non và sử dụng phương pháp súng bắn gen. Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều nhược điểm hơn phương pháp chuyển gen thông qua
Agrobacterium như: đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể gây ra sự xáo trộn trật tự của đối tượng chuyển, tần số biến nạp ổn định thấp, nhiều bản sao của gen biến nạp có thể được chuyển vào tế bào cùng lúc. Nghiên cứu chuyển gen vào giống sắn mô hình TMS 60444 trong điều kiện ở Việt Nam là một hướng đi mới và mang ý nghĩa
quan trọng cho sự phát triển của ngành trồng sắn ở nước ta hiện nay khi mà cây sắn trở thành cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa gạo và ngô. Hơn thế nữa, phương pháp tạo mô sẹo phôi hóa cũng là bước đi quan trọng cho việc tạo mô sẹo phôi hóa các giống Việt Nam nhằm phục vụ cho công tác cải thiện những nhược điểm của các giống sắn hiện có tại Việt Nam bằng công nghệ sinh học. Tuy nhiên, cho đến nay, Việt Nam mới có 1 công trình khoa học công bố về lĩnh vực kết quả tạo mô sẹo phục vụ cho chuyển gen vào cây sắn của nhóm tác giả Nguyễn Văn Đồng và cs [8].
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Vật liệu nghiên cứu: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi, đang trong giai đoạn phát triển do Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp được sử dụng để tạo mô sẹo phôi hóa (FEC) cho chuyển gen.
Hình 9: Cây sắn TMS 60444 in vitro 1 tháng tuổi
2.1.2. Vi khuẩn và các vector
- Chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA Dof1 chứa gen
Dof1 và chủng khuẩn A. tumefaciens EHA 105 mang vector pCAMBIA 1303 không chứa gen chức năng làm đối chứng (plasmid, vi khuẩn A. tumefaciens EHA 105 do Viện Nghiên cứu RIKEN, Nhật Bản cung cấp). Hai vector đều chứa gen chọn lọc kháng kháng sinh kanamycine (50mg/L) và hygromycine (25 mg/L)
Hình 10: Sơ đồ vector pCAMBIA 1303 [75]
Hình 11: Sơ đồ vector pCAMBIA Dof1 [75]
- Trình tự cặp mồi gen Dof1:
ZmDof1_F3_140407 GCGGGACACCAAGTTCTG ZmDof1_R3_140407 GAGGGGAAGTCGGAGAGG
2.1.3. Môi trường nghiên cứu Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy
Các loại môi trường nuôi cấy mô sẹo được cải tiến dựa trên các loại môi trường có trong nghiên cứu của Zainuddin và cs (2012):
- Môi trường MS (môi trường nhân cây in vitro): 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v), 0,3% Gelrite (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CAM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 0,1% BAP (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CIM: 1× muối MS và các vitamin, 2% sucrose (w/v) , 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường DKW: Hỗn hợp muối bazo và vitamin, 2% sucrose (w/v), 1% agar (w/v), CuSO4 2mM, 12mg/l picloram, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường MMS (1/10MS) có bổ sung 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), 12 mg/l picloram và vitamin, pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường MSN (môi trường tái sinh phôi tạo cây hoàn chỉnh): 1× muối MS và các vitamin, 1mg/l NAA, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường CEM (môi trường tạo rễ): 1× muối MS và các vitamin, 2 μM CuSO4, 0,4 mg/l BAP, 2% sucrose (w/v), 0,8% Noble agar (w/v), pH 5,8, khử trùng.
- Môi trường YEB đặc (yeast extract broth) dùng để chọn lọc Agrobacterium: 1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone, 5 g/l sucrose, 1,5% BactoTM agar (w/v), pH 7,2, khử trùng.
- Môi trường YEB lỏng (yeast extract broth) dùng để nuôi cấy Agrobacterium: 1 g/l BactoTM cao nấm men, 5 g/l BactoTM cao chiết thịt bò, 5 g/l BactoTM peptone, 5 g/l sucrose, pH 7,2, khử trùng. Bổ sung dung dịch MgSO4 vô trùng để đạt nồng độ cuối cùng 2 mM.
Các hóa chất khác
- Kháng sinh chọn lọc khuẩn: dung dịch kanamycin 50 mg/l. - Kháng sinh diệt khuẩn: dung dịch cefotaxime 200 mg/mL.
- Chất chọn lọc thực vật chuyển gen: dung dịch hygromycin 25mg/mL. - Dung dịch acetosyringone 200 mM.
Vật tư tiêu hao
+ Đĩa petri vô trùng 90 mm; rây nhựa vô trùng cỡ 100 μm; pipet 25 mL vô trùng; lọ thủy tinh vô trùng; ống falcon vô trùng 15 mL và 50 mL; ống Eppendorf (1,5 mL); parafilm; đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 μm); giấy nhôm; giấy lọc vô trùng; xi-lanh (10 mL); các loại đầu côn vô trùng; chậu; cốc nhựa; bình phun sương.
Trang thiết bị
+ Nồi khử trùng; pH mét; cân điện tử chính xác; máy ly tâm; máy lắc; buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (28°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối cường độ ánh sáng 3000 lux); buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (24°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối cường độ ánh sáng 3000 lux); bốc cấy vô trùng với đèn cồn; tủ lạnh (4°C) và tủ âm sâu (−20°C); panh, dao, kéo, thìa xúc; que cấy; tủ lắc ổn nhiệt (28°C); quang phổ kế; cu-vét 1 mL; thanh khuấy từ; máy vortex; micropipette; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa
Các cây sắn TMS 60444 in vitro cao khoảng 5-6 cm được sử dụng để làm vật liệu tạo mô sẹo phôi hóa theo 2 phương pháp:
- Phương pháp 1 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng chồi nách): Các cây con được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày, tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi
trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang môi trường MMS có chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mô sẹo và tạo mô sẹo phôi hóa. Mô sẹo phôi hóa được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối [8].
- Phương pháp 2 (tạo mô sẹo phôi hóa bằng thùy lá non): Các cây con 4-8 tuần tuổi sẽ được soi dưới kính hiển vi quang học để chọn ra các thùy lá ngọn còn non, chưa mở, dài khoảng 0,5-1 cm. Tách từng thùy lá non được chọn cho vào môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Sau 2-4 tuần thu được mô sẹo tiến hành các bước tiếp theo giống phương pháp 1.
Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:
Bả ng 3: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn
Giai đoạn Môi trường Hormone Thời gian
Chu kì sáng:tối (nhiệt độ) PP 1 PP 2
Tạo vật liệu khởi
đầu MS MS -
4-8
tuần 16h:8h (28°C) Tạo chồi nách CAM - BAP
10mg/L
2-4
ngày 0h:24h (28°C)
Tạo mô sẹo CIM CIM Picloram 12mg/L
2-4
tuần 0h:24h (28°C)
Chọn lọc mô sẹo DKW DKW Picloram 12mg/L
2-4
tuần 0h:24h (28°C)
Tạo và nhân mô sẹo phôi hóa
1/10MS (MMS) 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L 4–10 tuần 0h:24h (28°C)
Sự lựa chọn các thùy lá non, các cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mô sẹo phôi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.
Sự hình thành mô sẹo phôi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mô sẹo, màu sắc mô sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.
Tỷ lệ tạo mô sẹo được tính bằng số cụm mô sẹo trên số chồi ban đầu.
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa được tính bằng số cụm mô sẹo phôi hóa trên số chồi ban đầu.
2.2.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa
Các cụm mô sẹo phôi hóa từ 14-20 ngày tuổi có màu vàng tươi và tơi xốp được chọn và tách ra để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp.
Hình 12: Cụm mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444
2.2.2.1. Chuẩn bị dung dịch khuẩn và biến nạp
A. tumefaciens mang plasmid mang các gen cần chuyển đã được chuẩn bị sẵn. Khuẩn lạc sau chọn lọc của vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid cần chuyển được nuôi trong 10ml môi trường YEB (lỏng) có bổ sung kanamycin 50 mg/l, hygromycin 25mg/l nuôi lắc 100 vòng/phút ở 280C trong thời gian 48 giờ (OD600 = 0,7 - 1) [85]. Ly tâm dịch nuôi khuẩn với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để thu cặn A. tumefaciens. Hòa cặn trong MMS lỏng có chứa 200µM acetosyringone và đo OD600 của dung dịch, pha loãng ở giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7. Dung dịch này sẽ được sử dụng để lây nhiễm mô sẹo phôi hóa.
Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống Falcon 50ml có chứa mô sẹo phôi hóa, sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 2-4 phút. Loại bỏ dung dịch, thấm khô mô sẹo phôi hóa bằng giấy lọc vô trùng. Sau đó, chuyển mô sẹo phôi hóa sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường MMS có bổ sung AS (acetosyringone) 200µM) trong 4 ngày ở điều kiện chiếu sáng 16h sáng/8h tối với cường độ ánh sáng 3000 lux và nhiệt độ trong dải 200C, 220C, 240C, 260C.
2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime đến khả năng loại khuẩn thừa và tái sinh cây từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp thừa và tái sinh cây từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp
Khối mô sẹo được biến nạp sau 4 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để loại bỏ vi khuẩn. Rửa mô bằng dung dịch MMS đã khử trùng có bổ sung kháng sinh cefotaxime để diệt khuẩn. Sau đó, thấm khô mô phôi bằng giấy thấm vô trùng và chuyển chúng sang môi trường nhân mô sẹo (MMS) có bổ sung cefotaxime ở các nồng độ từ 0, 300, 400, 500, 600, 700 mg/l. Sau một tuần kiểm tra sự sống sót và mức độ nhiễm khuẩn của mô sẹo phôi hóa và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa.
Nồng độ cefotaxime thích hợp thể hiện thông qua tỉ lệ cụm mô sẹo phôi hóa sống sót mà không bị nhiễm khuẩn và đặc điểm mô sẹo phôi hóa trong môi trường tái sinh có bổ sung các dải nồng độ cefotaxime khác nhau.
2.2.2.3. Nghiên cứu nồng độ chất chọn lọc thực vật hygromycin thích hợp để chọn lọc mô được chuyển gen chọn lọc mô được chuyển gen
Để xác định được ngưỡng có tác dụng gây chết 100% của chất chọn lọc đối với mẫu đối chứng không chuyển gen để làm cơ sở cho chọn lọc cây chuyển gen. Các cụm mô sẹo phôi hóa chưa chuyển gen được đưa vào môi trường MMS có bổ sung hygromycin với dải nồng độ 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l và 25 mg/l. Theo dõi khả năng sống sót của các cụm mô sẹo phôi hóa này sau 8 tuần xác định ngưỡng gây chết của hygromycin cho chọn lọc mô chuyển gen.
Sau khi xác định được ngưỡng gây chết của hygromycin có khả năng chọn lọc mô chuyển gen tốt nhất, mô sẹo phôi hóa đã được loại bỏ dịch khuẩn sẽ được đưa vào môi trường nhân mô sẹo (MMS) có chứa cefotaxime với nồng độ thích hợp và chất chọn lọc thực vật là hygromycin ở nồng độ thấp. Cứ sau 7 ngày khối mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường MMS mới có chứa chất chọn lọc hygromycin với nồng độ tăng dần lên cho tới khi đạt nồng độ hygromycin thích hợp, nhằm đảm bảo khả năng sống sót và phục hồi của các mô yếu sau bước đồng nuôi cấy mà các mô này có khả năng mang gen chuyển. Sau đó các mô chuyển gen sẽ được chuyển đến môi trường tái sinh MSN có chứa nồng độ hygromycin thích hợp để tái sinh thành cây hoàn chỉnh [20], [85].
2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen
Các mô sống sót sau 3 - 4 tuần nuôi cấy tại MMS được chuyển sang môi trường tái sinh cây (MSN) có chứa cefotaxime và hygromycin ở nồng độ thích hợp với nhiệt độ 280C thời gian chiếu sáng 16h/ ngày đêm và cường độ chiếu sáng 2000 lux. Sau 14 tuần, các cụm chồi thật xuất hiện từ các cụm mô sẹo phôi hóa sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường tạo rễ (CEM) có bổ sung cefotaxime và hygromycin để tiếp tục chọn lọc. Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, các cây tái sinh được nhân trong môi trường MS, nuôi cấy trong 8 tuần để sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết DNA.
2.2.2.5. Phương pháp xác định sự có mặt của gen Dof1 trong cây sau chuyển gen a. Phương pháp sàng lọc nhanh khả năng tạo rễ a. Phương pháp sàng lọc nhanh khả năng tạo rễ
Để xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc nhanh các dòng chuyển gen kháng hygromycin bằng cách: sau khi thu được các chồi chuyển gen, cắt các chồi ngọn cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung cefotaxime và hygromycin ở nồng độ thích hợp để kiểm tra sự ra rễ [84]. Để
đảm bảo môi trường sàng lọc có hiệu quả, các cây TMS 60444 chưa chuyển gen cũng được sử dụng như đối chứng âm.
b. Sử dụng phương pháp phân tích PCR (Polymerase chain reaction):
Các cây sau khi tái sinh được thành cây hoàn chỉnh sẽ tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA theo phương pháp của Gilberston và cs [34] và phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen Dof1.
Sau khi thu được mẫu DNA tổng số, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 để kiểm tra sự có mặt của gen Dof1 trong cây như sau:
- Chuẩn bị các ống PCR có chứa các thành phần sau:
Bả ng 4: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3
Thành phần phản ứng Thể tích
(µl) Điều kiện
Nước 17,375 - Thời gian biến tính ban đầu: Đệm Taq DNA polymerase 10x
(Biolab) 2,5 95