Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.6. Xác nhận định danh Salmonella
Các chủng được xem là Salmonella, hoặc có thể là Salmonella sẽ tiến hành xác định type huyết thanh . Xác định type huyết thanh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp theo phương pháp của White-Kauffmann (WHO, 1983)
3.6.1. Nguyên liệu
- Chủng vi khuẩn Salmonella - Bộ kháng huyết thanh Salmonella
3.6.2. Phương pháp tiến hành
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella từ mơi trường đặc hiệu, ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, ủ ở 37oC / 24 giờ
* Tiến hành
- Định type kháng nguyên O
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O (20 àl) lờn phin kớnh
ã Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella đã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính.
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
• Quan sát:
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti.
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất khơng có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC, tương tự kháng huyết thanh poly O. Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh O đơn giá.
(Nguồn: Danan, 2009)
+ Nếu chủng âm tính với OMA, OMB, OMC, thì cần phải làm phản ứng tiếp theo với OMD, OME, OMF và OMG.
+ Nếu chủng ngưng kết với OMA, tiếp tục kiểm tra với nhóm 2; 4; 9; 9,46; 3,10; 1,3,19; 21
+ Nếu chủng ngưng kết với OMB, tiếp tục kiểm tra với nhóm 7; 8; 11; 13; 6,14
+ Nếu chủng ngưng kết với OMC, tiếp tục kiểm tra với nhóm 16; 17; 18; 28; 30; 35; 38
+ Nếu chủng ngưng kết với OMD, tiếp tục kiểm tra với nhóm 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45
+ Nếu chủng ngưng kết với OME, tiếp tục kiểm tra với nhóm 47; 48; 50; 51; 52; 53; 61
+ Nếu chủng ngưng kết với OMF, tiếp tục kiểm tra với nhóm 54, 55, 56, 57, 58, 59.
+ Nếu chủng ngưng kết với OMG, tiếp tục kiểm tra với nhóm 60, 62, 63, 65, 66, 67
- Định type kháng nguyên H
(Nguồn: Danan, 2009)
Nhiều chủng Salmonella có 2 pha kháng nguyên H. Tuy nhiên ở vi
khuẩn Salmonella đã nuôi cấy thường chỉ xuất hiện 1 pha. Pha 2 sẽ được phát hiện khi ức chế sự xuất hiện của pha 1 bằng cách nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh ức chế pha 1 vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H.
Pha 2:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: Đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa petri có đường kính 9mm. Trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1. Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6) SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10 SG2: ức chế Hd, Hi, He,h SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26 SG4: ức chế Hr, Hz SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15 Sg6: ức chế H1,2, H1,5, H1,6, H1,7, Hz6
- Dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở vị trí giữa đĩa thạch Sven gard.
- Ủ ở 37oC/ 24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.
Bảng 3.4. Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1
STT Kháng huyết thanh Các kháng nguyên H pha 1 bị ức chế
1 SG1 a + b + c + z10 2 SG2 d + i + e,h 3 SG3 k + y + l,v + l,w + l,z13 + l,z28 4 SG4 r + z 5 SG5 e, n, x + e, n, z15 (Nguồn: Viện Thú y, 2016)
(Ví dụ: Kháng nguyên H pha 1 xác định là Ai thì dùng SG2 để ức chế A)