Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.1. Một số hiểu biết về vi khuẩn Salmonella
2.1.5. Những yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn Salmonella
Lipopolisaccharide (LPS)
LPS là một thành phần cơ bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn
Salmonella, giữ vai trò là một yếu tố độc lực quan trọng của chúng.
- Cấu tạo phân tử LPS
Phân tử LPS của vi khuẩn Gram (-) gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính đối lập nhau: vùng thứ nhất là vùng ưa nước, vùng lõi ở trung tâm và vùng lipit A. Vùng ưa nước gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu trúc của kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acidic heterooligosaccharide nối kháng nguyên O với vùng lipit A (Orskov và cộng sự, 1977). Lipit A được cấu tạo bởi glucosaminyl β 1,6-glucosamine disaccharide, thay thế ở vị trí 1 và 4 bởi các nhóm PO43- tạo nên cầu nối pyrophosphate liên kết với glucosamine disaccharide. Nhóm hydroxyl và nhóm amino tạo nên cầu nối với chuỗi dài acid
béo và chỉ có β hydroxy acide béo là tham gia vào cầu nối amide. Chiều dài của chuỗi acid béo β hydroxy được đánh số và là đặc tính của các nhóm vi khuẩn riêng biệt. Thành phần acid béo trong chuỗi lipit A có thể chịu ảnh hưởng của thành phần mơi trường và khơng có mặt trong các acid béo khác thuộc thành tế bào vi khuẩn Gram (-). Do vậy, lipid A liên quan đến lipid vi khuẩn và chỉ trong điều kiện nuôi cấy xác định mới có thể đảm bảo chuỗi lipid A phát triển đầy đủ (Bradley, 1979).
Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt tế bào. Trên bề mặt các tế bào mẫn cảm với LPS tồn tại các receptor liên kết với LPS như tế bào lâm ba B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách. Bản chất của các receptor này là glycerolphosphatide. Cầu nối giữa LPS và glycerolphosphatide thực hiện được nhờ vào các cation hóa trị 2 hoặc 3, bởi vì cả hai yếu tố LPS và glycerolphosphatide đều mang điện tích âm.
- Tác động sinh học của LPS đối với một số cơ quan, mô bào
+ Tác động lên gan
Hoạt động trao đổi chất ở gan chịu tác động của LPS endotoxin, như cạn kiệt nguồn dự trữ carbohydrate, ức chế hoạt động enzyme, ức chế chuyển hóa glucose, gây hiện tượng tăng đường huyết tạm thời tiếp theo là giảm lượng đường huyết nghiêm trọng. Tăng đường huyết ban đầu là do kết quả quá trình phân giải glycogene gan. Thiếu đường huyết là hậu quả của quá trình tăng cường sử dụng glucose của các mô bào ngoại vi và suy giảm chức năng gan. Nội độc tố (LPS) gây tổn thương gan dẫn đến tăng cường hoạt động của men tranaminase huyết thanh trong một vài giờ đồng thời sau khi tiêm trực tiếp nội độc tố, làm giảm hoạt lực men oxygennase. Hoạt động của một số enzyme thuộc bào quan mitochondria giảm xuống rõ rệt ở tế bào gan chuột nuôi cấy trong thời gian 2 giờ sau khi bổ sung 10µg LPS/ml. Điều đó chứng minh rằng LPS tác động trực tiếp lên tế bào nhu mô gan (Bradley, 1979).
+ Tác động lên cơ quan miễn dịch
Endotoxin tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. Tế bào đơn nhân lớn, bạch cầu trung tính nhanh chống tập trung các mạch máu ngoại vi vùng xoang bụng. Sau khi tiêm LPS với liều lượng vài µg, đã đẩy nhanh quá trình thành thục và tăng số lượng lâm ba cầu B. LPS được coi là một kháng
ngun và do vậy có khả năng kích thích hình thành kháng thể.
+ Tác động tế bào
Tế bào đại thực bào, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu, tiểu cầu, lâm ba cầu B và nguyên bào sợi fibroblast là những tế bào mẫn cảm với LPS. LPS thể hiện độc tính với tế bào đại thực bào chuột lang với liều 50µg. Sau khi tiếp xúc với LPS 5 phút chúng đã giải phóng lysosome enzym. LPS khơng có khả năng tác động lên q trình phân bào của các tế bào đại thực bào.
Tế bào đại thực bào ở máu ngoại vi chuột nhắt được hoạt hóa bởi LPS trong ống nghiệm có khả năng tiêu diệt các tế bào khối u bằng tiếp xúc trực tiếp. Lysosome được chuyển từ tế bào đại thực bào hoạt hóa tới bào tương của các tế bào mẫn cảm và gây dung giải các tế bào đó. Tác động độc lên tế bào bị ức chế bởi hydrocortisol bằng cách cản trở quá trình vận chuyển lysosome vào nguyên sinh chất tế bào đích. Hơn nữa, tác động độc tế bào của các tế bào đại thực bào hoạt hóa có thể bị ức chế bởi trypan blue, một tác nhân ức chế enzym của lysosome. Các tế bào đại thực bào hoạt hóa đã được xử lý với các trypan blue có thể chuyển lysosome của chúng tới nguyên sinh chất tế bào, dung giải các tế bào đó. Lysosome đã được hoạt hóa bởi LPS tác động lên nhân tế bào chủ của nó gây nên hiện tượng phân bào trong tình trạng khơng tổng hợp DNA và làm dung giải các chất tế bào đích.
LPS tiếp xúc q trình giải phóng lysosome enzym từ bạch cầu hạt nhân đa hình thái (polymorphonucleas leucocytes) (PMN). Bạch cầu PMN liên quan đến q trình tổn thương mơ bào trong các q trình viêm, kể cả viêm khớp. Hầu hết những quá trình viêm, tổn thương này là do PMN lysosome enzym bởi khả năng tiêu hóa các tiểu phần mơ liên kết, tăng tính thấm thành mạch, hoạt hóa các yếu tố trung gian gây viêm khác như kinin. Bạch cầu PMN người chứa hai loại nguyên sinh chất tế bào: là các hạt trung tính và các hạt ái kiềm. Các hạt trung tính chứa phosphataza kiềm và lysosome, trong khi đó các hạt ái kiềm chứa hydrolaza và các enzym lysosome khác. LPS tác động làm thối hóa các hạt nên giải phóng enzym tác động lên các tế bào đích.
Tác động của LPS lên tế bào tiểu cầu góp phần gây nên tình trạng “shock” nội độc tố, được giải thích theo các cơ chế sau: (1) giải phóng các chất hoạt động thành mạch như histamin và serotonin; (2) ngưng kết các tiểu cầu nội mạch; (3) đơng vón, tắc mạch quản. Ở chó, khi tiêm 0,9mg nội độc tố E.coli gây giảm áp lực
máu động mạch chủ, giảm tế bào bạch cầu từ 1,5x104 xuống 5x103/mm3, giảm số lượng tiểu cầu từ 2,4x105 xuống 2,3x104/mm3 sau thời gian 5 phút (Bradley, 1979).
LPS kích thích q trình phân bào của các tế bào lâm ba dưới tác dụng nâng cao mức GMP vòng nội bào, tăng cường quá trình hấp thụ amino axit và các ion như Ca+2.
LPS tác động đến q trình biệt hóa các tế bào lâm ba dẫn đến hiện tượng tăng số lượng tổng hợp các globulin miễn dịch bao gồm IgM và IgG. LPS ảnh hưởng trực tiếp đến chức năng bào của T cũng như các tế bào khác tham gia miễn dịch trung gian tế bào thông qua tác động hợp đồng cùng concanavalin A kích thích các tế bào lâm ba cầu T tăng cường hoạt động (Bradley, 1979).
Springer và Adge (1975), trích dẫn bởi Bradley (1979), cho biết trên bề mặt tế bào lâm ba cầu B, tế bào đại thực bào tồn tại một loại kháng nguyên với tên gọi là (Histocompatoibility antigens) chính yếu tố kháng nguyên này là receptor của LPS.
+ Tác động của LPS lên các bào quan
Tác động lên lysosome: Lysosome là đích tấn cơng của LPS, kết quả trên
đã được kiểm tra trên động vật thí nghiệm. Sau khi tiêm LPS cho chuột cống trắng đã làm tăng hoạt động của cathepsin trong gan và cơ. LPS gây nên hiện tượng bài xuất các enzym của lysosome bao gồm cathepsin và glucorunonidaza trong vòng 5 đến 30 phút.
Cơ chế tác động của nội độc tố LPS lên lysosome được tóm tắt như sau: sau khi bám lên các receptor đặc hiệu, LPS được hấp thu theo cơ chế hấp thu nội bào rồi được chuyển vào trong nguyên sinh chất tế bào, tại đây chúng kết hợp với lysosome hình thành lysosome thứ cấp. Q trình kết hợp đó làm phá vỡ lysosome giải phóng các enzym. Đồng thời các lysosome thứ cấp tác động lên nhân tế bào gây nên hiện tượng phân bào, tăng cường tổng hợp mRNA dẫn tới tăng cường lượng enzym lysosome. Những enzym đó gây nên hiện tượng tiêu hóa nội bào dẫn tới phá hủy mitochondria và các bào quan khác.
Tác động đến mitochondria: Tác động lên mitochondria là một trong những tương tác của nội tố LPS lên các bào quan quan trọng. Cơ chế tác động lên mitochondria được tóm tắt như sau: sau khi được vận chuyển qua màng vào nguyên sinh chất tế bào, LPS bám lên màng ngoài mitochondria rồi được vận chuyển vào màng trong. Tại đây, chúng làm thay đổi cấu trúc và chức năng của màng này dẫn
đến tăng cường hoạt động của ATPaza. Do ATPaza tăng cường hoạt động, kết quả tích lũy ADP vơ cơ trong nguyên sinh chất tế bào, hiện tượng đó làm tăng cường phân giải glucoza. Do tác động giữa LPS với mitochondria dẫn tới bài xuất H2O2 và O2 phá hủy màng bào quan khác (Bradley, 1979).
+ Tác động của LPS lên quá trình trao đối chất
Tác động lên quá trình trao đổi chất glucid: Tiêm nội độc tố đối với
chó thí nghiệm nhanh chóng gây lên hiện tượng giảm đường huyết. Hiện tượng trên liên quan đến sự thay đổi hoạt động của các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất. Đặc biệt là hiện tượng giảm hoạt lực của enzyme phosphoenolpyruvate carboxylkinaza, glycogensynthaza,fructo-1,6-diphosphataza. Pyruvatkinaza, enzym liên quan đến phân giải glycogen phosphorylaza cùng tăng lên ở động vật đã được xử lý với LPS. Berry và cộng sự (1978), trích dẫn bởi Bradley (1979), cho biết LPS gián tiếp tác động đến q trình giải phóng epinephrine đồng thời ảnh hưởng của cortisol lên phosphoenolpyruvat carboxykinaza bị ức chế bởi yếu tố trung gian glucocorticoid – antagonizing hơn là tác động trực tiếp của LPS. Yếu tố glucocorticoid – antagonizing được tạo ra bởi tế bào đại thực bào gần giống với interferon mà là một chất điều khiển chưa được xác định, chúng ức chế cả hai quá trình nối mạch polypeptide và ức chế giai đoạn khởi động tổng hợp protein (Bradley, 1979).
Sau khi tiêm LPS hàm lượng đường trong máu bắt đầu tăng và đạt giá trị cực đại sau 2 giờ, sau đó giảm dần và dẫn tới tình trạng giảm đường huyết, điều đó có liên quan với tình trạng suy kiệt nguồn glycogen dự trữ ở gan, tăng lactate và giảm pyruvate trong máu và mô bào, ức chế hoạt động của men succinate dehydrogenase ở cơ và ở gan. Vì những lý do nêu trên, nên việc bổ sung glucose mang lại kết quả khả quan cho những gia súc bị trúng độc nội độc tố. Insuline có vai trị quan trọng trong q trình trao đổi glucose. Insuline kích thích tế bào sử dụng glucoseamino a xít cũng như tăng cường q trình tổng hợp glycogen ở gan. Cả LPS và insuline đều gây nên tình trạng giảm đường huyết (Bradley, 1979).
Rất nhiều enzym tham gia vào q trình oxy hóa như enzym liên kết sắt, NADH dehydrogenaza, succunate dehydrogenaza, glycerol 3-phosphate dehydrogenaza, aconitaza và cytochrome oxydaza. Trong thời gian các tế bào thực bào hoạt động, nhu cầu sử dụng oxy, phân giải glycogen, glucoza tăng lên. Các yếu tố phân giải glucoza, glycogen cản trở q trình thực bào, trong khi đó các
yếu tố ức chế trao đổi oxy khơng có khả năng ức chế cản trở quá trình trên. H2O2 được sản sinh là kết quả của quá trình tái tạo NADP từ NADPH bởi sự xúc tác của NADPH oxydaza với oxy phân tử như là một chất nhận điện tử. NADP đóng vai trị quan trọng trong quá trình đường phân các loại đường 6 carbon. LPS kích thích sử dụng glucoza bởi các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính bằng hai con đường: kích hoạt các men phân giải glucoza và tăng cường hoạt động của NADHP oxydaza (Bradley, 1979).
Enterotoxin
Salmonella sản sinh enterotoxin, độc tố này được gọi là CT-like enterotoxin (choleratoxin like entrerotoxin). CT – like enterotoxin có cấu trúc, chức năng sinh học và đặc tính kháng nguyên giống với choleratoxin (CT) và LT của Escherichia coli (Clarker, 1988).
CT-like enterotoxin được cấu tạo từ hai tiểu phần A và B. Tiểu phần A có trọng lượng phân tử 25kDa, tiểu phần B có trọng lượng phân tử 12kDa.
Cơ chế tác động chính CT-like enterotoxin được tóm tắt như sau: tiểu phần B và A được tổng hợp nội bào sau đó vận chuyển qua màng tế bào, tại đây chúng liên kết với nhau tạo thành độc tố hoàn chỉnh rồi bài xuất ra ngoài. Tiểu phần B gắn với recepror: GM1 ganglioside trên màng tế bào biểu mơ ruột, sau đó tiểu phần A thực hiện chức năng hoạt hóa men nội bào. Hệ thống men adenylate cyclaza tăng cường hoạt động làm tăng mức cAMP và prostaglandin E2 (PGE2). Hiện tượng trên tạo ra tình trạng tăng cường bài xuất nước và các chất điện giải từ mô bào vào xoang ruột, cản trở hấp thu và gây thối hóa lớp tế bào villi thành ruột gây nên tiêu chảy (Clarke và Gyles, 1993).
Clarker (1988) cịn mơ tả một dạng độc tố đường ruột khác do Salmonella sản sinh. Dạng độc tố này khơng bị trung hịa bởi kháng thể kháng CT-like toxin, chúng bền vững với nhiệt, làm chương trình tế bào Chinese Hamster Ovary (CHO), tập trung dịch bằng phương pháp phân đoạn ruột thỏ. Đó chính là nhóm độc tố đường ruột chịu nhiệt (Heat stable enterotoxin) do Salmonella sản sinh.
Cytotoxin
Tổn thương tế bào biểu mô ruột là một đặc điểm quan trọng do
Salmonella gây ra trong tự nhiện cũng như thực nghiệm. Tổn thương trên là do
độc tố tế bào (cytotoxin) gây ra (Clarke, 1988).
mẫn cảm với trypsin được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella. Dạng độc tố này có phân tử lượng khồng 56-78kDa, chúng khơng bị trung hòa bởi kháng thể kháng độc tố shigatoxin hoặc shiga-like-toxins. Cơ chế tác động chính của độc tố này là ức chế tổng hợp protein của tế bào Hela, gây ức chế và teo tế bào. Dạng thứ hai có nguồn gốc từ protein màng tế bào vi khuẩn. Dạng độc tố này có cấu trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng EIEC sản sinh chúng có mặt ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh. Dạng thứ 3 có trọng lượng phân tử khoảng 26kDa. Dạng độc tố này thường liên quan với độc tố hemolysin. hemolysin liên hệ với độc tố tế bào khác biệt với các hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động. Hemolysin dạng này là protein có trọng lượng phân tử 62kDa, cùng với cytotoxin, hemolysin dung giải các khơng bào nội bào. Trong phịng thí nghiệm, độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO (Rahman và cộng sự, 1992).
Flagella
Vai trò độc lực của flagella phụ thuộc vào các serotype Salmonella. Di
động bằng flagella là cần thiết để xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột đối với
S.typhi, trong đó đối với S.typhimurium là không cần thiết. Chức năng của
flagella là giúp cho vi khuẩn chuyển động, tăng cường cơ hội tiếp xúc với tế bào biểu mô ruột, tạo điều kiện cho vi khuẩn tập trung và tương tác với lớp tế bào này (Clarker và Gyles. 1993).
Không bào chứa sắt
Người và động vật có cơ chế liên kết và hấp thụ sắt từ thức ăn vì vậy khả năng cung cấp sắt cho nhu cầu phát triển của vi sinh vật ở mô bào, dịch mô bào là rất hạn chế. Protein vận chuyển sắt của vật chủ bao gồm: Transferrin, lactoferin, ferritin và hemoglobin. Để đảm bảo nhu cầu sắt cho quá trình phát triển của mình trong cơ thể vật chủ, vi khuẩn hình thành các khơng bào có ái lực mạnh với sắt (siderophore). Siderophores được tổng hợp bên trong tế bào vi khuẩn rồi bài xuất ra ngồi dịch thể mơ bào vật chủ, tại đây chúng thu nhận sắt rồi được hấp thụ trở lại các recceptor protein đặc hiệu màng ngoài tế bào vi khuẩn. Sắt từ phức hợp sắt – siderophore sẽ được vi khuẩn sử dụng cho hoạt động sống của chúng (Clarker và Gyles, 1993).
S. typhimurium tạo ra enterobactin một dạng siderophore gọi là phenolate
nghiệm trên chuột, Benjamin và cộng sự (1985) kết luận: khi căn bệnh ký sinh nội bào chúng không cần đến hệ thống thu nhận sắt trên đây, mà hệ thống này thực sự là một yếu tố độc lực giúp cho vi khuẩn tăng mạnh về số lượng khi phát triển bên ngoài tế bào. Lợn gây nhiễm với S.cholerae suis, vi khuẩn có khả năng