3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.7.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
1.7.2.1. Chẩn đoán virus học
Bệnh phẩm là phân, chất chứa ở đường tiêu hóa hoặc dịch ngoáy ổ nhớp và khí quản đối với gia cầm sống; não, gan, lách, phổi của gà bệnh mới chết. Bệnh phẩm được nghiền với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/10, xử lý kháng sinh (20% thể tích), để kháng sinh tác động ở nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ, ly tâm 1.000 vòng/phút trong 10 phút và lấy nước trong ở trên (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
Gây bệnh cho phôi gà: Bệnh phẩm được tiêm cấy vào phôi trứng gà 9 - 11 ngày tuổi, tốt nhất lấy phôi gà của đàn gà SPF (Specific Pathogen Free) hoặc nuôi cấy trên môi trường tế bào sợi phôi gà hay môi trường tế bào thận phôi gà hoặc gà không có kháng thể Newcastle. Mỗi mẫu tiêm 0,2ml/ phôi, tiêm 5 phôi vào xoang niệu mô. Phôi chết sau 4 - 7 ngày, để lạnh ở 4°C rồi thu hoạch lấy nước trứng. Sự hiện diện và nhân lên của virus sẽ gây chết phôi hoặc tạo những bệnh tích đặc hiệu trên môi trường tế bào. Virus được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA = haemagglutination test) và virus Newcastle được khẳng định chắc chắn dựa vào phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI = haemagglutination inhibition test) với kháng thể chuyên biệt chống virus Newcastle (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
Khi kiểm tra bệnh tích của phôi thường thấy, virus Newcastle đường phố giết chết bào thai từ 30 - 48 giờ sau khi tiêm với sự xuất hiện của đám xuất huyết trên da và tổ chức liên kết dưới da. Kiểm tra nước trứng thấy có hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà. Những bào thai sống quá 48 giờ cũng cần kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu vì có một số chủng yếu, nhiều lần tiêm truyền đầu tiên virus chưa giết chết bào thai. Trường hợp kết quả âm tính cần tiếp tục tiếp đời thụ động thêm vài lần trong bào thai trứng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978).
Gây nhiễm cho môi trường tế bào: có thể sử dụng nhiều loại môi trường tế bào nhưng phương pháp gây nhiễm vào tế bào xơ phôi gà một lớp được sử dụng phổ biến.
Nếu bệnh phẩm có virus, sau 72 giờ gây nhiễm virus gây bệnh tích tế bào kiểm tra dưới kính hiển vi sẽ thấy lớp tế bào trên mặt thành ống nghiệm thiếu đồng đều, nguyên sinh chất tan rã, nhân tế bào vón lại từng đám. Căn cứ vào các chỉ số để xác định độc lực của virus. Lấy dịch nuôi cấy tế bào làm phản ứng HA sẽ cho kết quả dương tính (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
Gây bệnh cho gà: yêu cầu sử dụng gà khỏe mạnh, không nằm trong vùng có dịch và chưa tiêm vaccine phòng bệnh Newcastle lần nào. Tiêm 1ml vào dưới da hay bắp thịt. Mỗi mẫu đem tiêm cho 2 - 3 gà. Sau 3 - 5 ngày sẽ xuất hiện các dấu hiệu đầu tiên của bệnh. Sau 7 - 10 ngày gà chết mổ khám thấy bệnh tích giống như của gà mắc bệnh ngoài tự nhiên (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
Gây bệnh trên chim: tiêm vào dưới da chim bồ câu huyễn dịch bệnh phẩm là óc, tủy xương của gà bệnh, 6 - 7 ngày bồ câu ủ rũ, sốt nhiệt độ lên đến 43oC, bỏ ăn, sã cánh, 11 - 12 ngày sau con vật uống nhiều nước, ỉa phân trắng lỏng rồi xanh, bại liệt chân và thân mình rồi chết. Nếu tiêm dung dịch nước trứng có chứa virus, thì ngày thứ 8 bồ câu ỉa lỏng, ỉa phân trắng rồi phân xanh và chết ở ngày thứ 11 - 13. Mổ khám thấy niêm mạc miệng có phủ chất màu trắng, cuống mề tụ máu, xuất huyết (Lê Văn Tạo, 2005). Tiêm vào bắp thịt đùi chim ri dung dịch nước trứng có chứa virus pha ở nồng độ 103, con vật bị tê liệt lúc gần chết, thời gian chết có thể từ 7 - 13 ngày. Mổ khám có bệnh tích tụ máu toàn thân, mặt sưng, khí quản có chất lầy nhầy (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997).
1.7.2.2. Chẩn đoán huyết thanh học
Chẩn đoán nhanh hiện nay được thực hiện bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) hay real-time RT-PCR để phát hiện virus Newcastle có trong các mẫu bệnh phẩm là tổ chức cơ thể, dịch chất ở hầu họng/ ổ nhớp hay phân gia cầm (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
Virus được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutinin test). Xác định virus Newcastle bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutinin inhibition test) với kháng thể chuyên biệt kháng virus Newcastle. Ngoài ra còn một số kỹ thuật khác để phát hiện virus như kỹ thuật ELISA, các phản ứng trung hòa, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch, nhưng phổ biến nhất là dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013).
➢ Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Do đặc tính của virus Newcastle và dịch tả gà (nay gọi là cúm gia cầm) đều làm ngưng kết hồng cầu gà nên có thể dùng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) để phát hiện hai virus này cũng như các virus khác trong bệnh phẩm. Đây không phải là phản ứng huyết thanh học, nhưng người ta lợi dụng đặc tính sinh học của những virus này,
để phát hiện và định lượng kháng thể đặc hiệu virus trong huyết thanh. Đó là phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI). Khi cho huyết thanh chứa kháng thể trộn lẫn với virus thì nếu trong huyết thanh có kháng thể thì virus bị “trung hòa” và mất năng lực gây ngưng kết hồng cầu. Độ pha loãng huyết thanh gây ngưng kết hồng cầu càng cao chứng tỏ nồng độ kháng thể càng lớn. Như vậy có thể bán định lượng hay xác định hiệu giá kháng thể (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006). Sau khi gà tiêm phòng vaccine Newcastle có thể lấy máu gà, chắt huyết thanh để xác định hàm lượng kháng thể chống virus Newcastle có trong máu gà ở từng thời điểm khác nhau bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà.
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh Newcastle (Vesna và cs, 1992). Giá trị của phản ứng phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của gia cầm và việc tiêm phòng vaccine. Kiểm tra huyết thanh ở gà không tiêm vaccine thấy có hiệu giá HI = 1/8 (3log2), kèm theo dấu hiệu lâm sàng của bệnh được xem là gia cầm mắc bệnh Newcastle (Beard và Hanson, 1984).
➢ Phương pháp ELISA (Enzyme-Linking Immunosorbent Assay)
Phản ứng ELISA là một trong những phương pháp sử dụng kháng thể đánh dấu. Phương pháp này có các biến thể khác nhau: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. Phương pháp ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đánh dấu enzyme (conjugate) trực tiếp chống lại (kết hợp với) kháng nguyên trong thành phần kháng nguyên của mầm bệnh. ELISA gián tiếp sử dụng conjugate chống lại kháng thể (thường là một phần của kháng thể, chuỗi H) của một loài động vật nhất định. Ưu điểm của phương pháp ELISA gián tiếp là có độ nhạy cao, nhưng chúng chỉ sử dụng được đối với huyết thanh của loài động vật hay đối tượng nhất định. Các kit (bộ) ELISA gián tiếp thiết kế để phát hiện kháng thể gà không thể phát hiện kháng thể của vịt. Vì vậy, hiện tại với phương pháp này chỉ có thể phát hiện kháng thể kháng virus Newcastle trên gà và gà tây. Phát hiện được kháng thể sớm nhất trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006).
➢ Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp này có thể phát hiện sự có mặt của RNA của virus. Đây là phương pháp hai bước nhân gen liên tục. Ban đầu lấy RNA làm khuôn tổng hợp DNA tương bổ do enzyme RT xúc tác, sau đó dùng phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu nhờ enzyme Taq DNA polymerase và cặp mồi (primer) gắn một cách đặc hiệu vào hai vị trí của DNA khuôn, sao cho việc nhân lên kéo dài từ mồi này sẽ cho sản phẩm làm khuôn DNA một sợi làm khuôn cho mồi kia và ngược lại. Phản ứng này có ưu điểm là cho kết quả nhanh với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hạn chế của phương pháp là không phát hiện những trường hợp nhiễm virus trước đây (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006).
➢ Thí nghiệm trung hòa
* Trung hòa trên gà thí nghiệm
Dùng hai lô gà, một lô thí nghiệm và một lô đối chứng. Lô thí nghiệm được tiêm vaccine Newcastle, lô đối chứng không được tiêm vaccine. Sau 5-7 ngày cả hai lô đều được tiêm bệnh phẩm của gà nghi mắc bệnh Newcastle vào dưới da hay bắp thịt đùi của gà. Nếu bệnh phẩm chứa virus Newcastle thì ở lô thí nghiệm gà không bị chết mà vẫn phát triển bình thường, bởi vì sau khi tiêm vaccine gà đã có kháng thể chống lại virus Newcastle, nên khi tiêm bệnh phẩm vào thì virus Newcastle có trong bệnh phẩm đã bị kháng thể này trung hòa, không còn virus để gây bệnh cho gà được. Trong khi đó ở lô đối chứng, gà bị chết, bởi vì ở lô gà này không được tiêm vaccine nên không có kháng thể chống virus Newcastle để bảo vệ cho gà (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997).
* Trung hòa trên môi trường tế bào tổ chức, phôi thai gà và động vật thí nghiệm
Mỗi đối tượng nghiên cứu trên dùng hai lô: Lô thí nghiệm, được tiêm hoặc cấy bệnh phẩm sau khi đã được hỗn hợp với một kháng huyết thanh Newcastle tương đương để ở 37oC trong 1 - 2 giờ. Lô đối chứng, chỉ được tiêm và cấy bệnh phẩm nghi có virus Newcastle. Kết quả: nếu trong bệnh phẩm có chứa virus Newcastle thì các lô thí nghiệm là môi trường tế bào tổ chức, phôi thai gà và động vật thí nghiệm vẫn phát triển và sống bình thường, vì virus có trong bệnh phẩm đã bị kháng huyết thanh Newcastle trung hòa, không còn virus để gây hủy hoại tế bào hoặc làm chết phôi gà hay động vật thí nghiệm. Trong khi đó, ở lô đối chứng thì tế bào nuôi cấy bị hủy hoại, phôi gà và gà bị chết (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997).