3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3.3. Nghiên cứu sự lưu hành của kháng nguyên virus Newcastle
2.3.3.1. Bố trí lấy mẫu
Đối tượng nghiên cứu là quần thể gà ở 20 xã thuộc huyện Tây Sơn và thị xã An Nhơn, tỉnh Bình Định, gồm các vùng, địa hình đặc trưng khác nhau. Gà chăn nuôi nông hộ qui mô nhỏ lẻ tại thời điểm nghiên cứu không được tiêm chủng vaccine, phân gà là nguyên liệu xét nghiệm kháng nguyên duy nhất. Trong mỗi đơn vị lấy 10 xã, mỗi xã lấy ở 3 thôn, tối thiểu 30 mẫu, cụ thể như được nêu ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11 trong mục Kết quả nghiên cứu. Mẫu phân được lấy từng cá thể gà trong thời gian 3 tháng (từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015), với tổng số đã thu được 633 mẫu.
2.3.3.2. Phương pháp lấy và xử lý mẫu
Phân lấy từ các cá thể gà, được cho vào một túi polyethylene (PE) sạch. Buộc miệng túi chứa phân và cho vào một túi PE thứ hai, kèm mẫu giấy ghi thông tin về mẫu phân, buộc chặt miệng túi thứ hai và đặt vào hộp đựng đá bảo ôn chuyên dụng, sau đó chuyển về bảo quản ở tủ lạnh sâu (-20oC) cho đến khi sử dụng.
Khi chiết mẫu cần tính trước lượng dịch cần thiết cho các phản ứng từ mỗi mẫu phân. Nếu cần thực hiện một phản ứng từ một mẫu phân thì cho vào ống Eppendorf (vô trùng) 100µl nước sinh lý, dùng nạo xương y tế số #0001 (đã tiệt trùng) gạn lấy
mẫu phân trong túi polyethylene, lấy vừa đầy nạo rồi khuấy đầu nạo đó vào ống Eppendorf chứa nước sinh lý cho hòa tan hết phân. Mỗi lần như vậy hòa được 10mg phân vào 100µl nước sinh lý. Mỗi ống Eppendorf sẽ dùng cho một mẫu phân. Huyễn dịch phân sau đó được quay ly tâm trong thời gian 5 phút với tốc độ 14000 vòng/phút. Hút lấy dịch trong suốt ở trên ống cho vào một ống Eppendorf mới (ghi kí hiệu số mẫu tương ứng ở túi lên ống) để làm nguyên liệu cho các phản ứng. Cất ở tủ lạnh sâu -20oC các mẫu dịch chiết trong suốt này khi chưa thực hiện phản ứng (Nguyễn Thị Hoàng Oanh và cs, 2012).
2.3.3.3. Xét nghiệm xác định hiệu giá kháng nguyên của các mẫuthu được
Phương pháp Trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu trực tiếp chuẩn (SSDHI, còn gọi là phương pháp trắc định suy giảm kháng thể HI đặc hiệu, hay trắc định suy giảm HI đặc hiệu, do đa số trường hợp xê lệch là giảm) được sử dụng để xét nghiệm xác định hiệu giá kháng nguyên virus Newcastle như đã được mô tả trước đây (Nguyễn Thị Hoàng Oanh và cs, 2012). Phương pháp này bao gồm các bước:
(1) Chuẩn bị nguyên liệu chuẩn cho phản ứng: HA để xác định hiệu giá ngưng kết hồng cầu của dịch virus Newcastle nguyên liệu, pha virus đến nồng độ 4HA, thực hiện HI đo hiệu giá kháng huyết thanh nguyên liệu chống virus Newcastle để pha kháng huyết thanh đến nồng độ 4HI.
(2) Chuẩn bị mẫu kháng nguyên: phân được quấy vào nước cất với lượng tương đương, trộn kỹ, quay ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, hút dịch mặt trong suốt.
(3) Thiết lập phản ứng: trên khay vi chuẩn độ 96 lỗ giếng (12 dãy 8 cột) xoay ngang sao cho mỗi khay có thể sử dụng để xét nghiệm 11 mẫu kiểm hoặc song song với một mẫu chuẩn trong đó nước sinh lý thế chỗ cho dịch chiết mẫu phẩm. Nguyên tắc là nếu có kháng nguyên trong mẫu kiểm thì kháng nguyên đó do tiếp xúc trước với kháng huyết thanh và làm giảm hiệu giá của kháng thể chuẩn 4log2 trong phản ứng với hồng cầu sau đó. Các mẫu có kháng nguyên NDV sẽ làm hiệu giá HI giảm xuống 1, 2 hoặc 4 mức ứng với hiệu giá kháng nguyên 1log2, 2log2, 3log2 và 4log2, theo trình tự các bước thể hiện ở Bảng 2.3. Trong đó HA và HI được sử dụng như trường hợp kiểm tra kháng thể trong huyết thanh gà như trình bày ở các mục tương ứng.
Đọc kết quả: dựa vào hiện tượng xê lệch hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu (giảm hiệu giá HI) của huyết thanh nguyên liệu chuẩn (số lỗ có hồng cầu chìm giảm đi so với dãy lỗ chuẩn đối chứng âm tính). Tức bắt đầu đọc kết quả khi dãy chuẩn thể hiện rõ: 4 lỗ đầu và lỗ thứ 8 không có ngưng kết, hồng cầu chìm xuống giữa tâm lỗ khay (không ngưng kết) có thể gặp trường hợp 3 lỗ đầu hoặc 5 lỗ đầu của dãy chuẩn không ngưng kết (do nồng độ kháng nguyên gắn hồng cầu thay đổi ngẫu nhiên). Khi đó đường chuẩn sẽ làm sau 3 hoặc 5 lỗ khay đầu tương ứng. Dịch lọc bệnh phẩm tiếp
xúc trước với kháng huyết thanh, nếu chứa kháng nguyên virus Newcastle thì sẽ làm giảm kháng thể đặc hiệu trong kháng huyết thanh, phản ứng sẽ biểu hiện lệch trái so với dãy chuẩn.
Bảng 2.3. Các bước phản ứng trắc định xê lệch ngăn trở ngưng kết hồng cầu trực tiếp
chuẩn (SSDHI)
Nguyên liệu Lỗ (Giếng) số
1 2 3 4 5 6 7 8
Nước sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25
Dịch bệnh phẩm 1:1 trong suốt (mỗi mẫu vào một lỗ đầu dãy mẫu kiểm) hoặc Nước sinh lý (một lỗ đầu của dãy đối chứng âm tính) (µl)
25
Huyết thanh gà 16 -64 HI (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25
Độ pha loãng của dịch mẫu trong
kháng huyết thanh 4HI 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216
Kháng nguyên Newcastle 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25
Hồng cầu gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25