3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo cứu tỷ lệ tiêm phòng và tỷ lệ mắc bệnh Newcastle ở gà nuôi tại Bình Định
2.3.1.1. Nguyên liệu/tư liệu
Thông tin là các báo cáo định kỳ và tổng kết năm của Chi cục Thú y trong giai đoạn 2010 - 2015 được thu thập, tổng hợp và xử lý phân tích mối tương quan giữa tỷ lệ tiêm phòng với tỷ lệ mắc bệnh và tình hình phát dịch tại địa bàn.
2.3.1.2. Phương pháp xử lý
Áp dụng phương pháp phân tích Hệ số liên quan thứ bậc với công thức sau đây: rrange=1-{6∑d2/(n(n-1)(n+1))} (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006), như ví dụ: “Đánh giá ảnh hưởng của tiêm vaccine đối với tỷ lệ mắc bệnh: làmột trong những bài toán thực tiễn đòi hỏi ngay cả khi vaccine đã được nhà sản xuất thực nghiệm và khuyến cáo sử dụng. Một trong những phương pháp là phân tích tính phụ thuộc giữa tỷ lệ gia cầm được tiêm vaccine và tỷ lệ mắc bệnh (sau khi vaccine theo lý luận phải có hiệu lực) hàng năm. Ví dụ dữ liệu thu được 10 năm (1990 - 1999) trong bảng sau giúp ta giải quyết vấn đề này.
Năm 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99
Tỷ lệ tiêm vaccine (%) 55 57 63 64 62 68 71 75 74 77
Tỷ lệ mắc bệnh (%) 1,8 1,7 2,1 1,6 1,2 1,4 0,9 0,8 0,8 0,6
Có một số phương pháp xác định mối phụ thuộc giữa hai dãy số liệu. Trong đó, phương pháp xác định hệ số liên quan thứ bậc rrange là khá tiện lợi. Hệ số rrange mang giá trị từ -1 đến +1. Giá trị dương chỉ mối tương quan thuận, tức cùng tăng cùng giảm, giá trị âm chỉ mối tương quan nghịch. Giá trị từ 0 đến 0,5 chỉ mối phụ thuộc yếu, từ 0,5 đến 0,8 chỉ mức trung bình, lớn hơn 0,8 đến 1 chỉ mối quan hệ phụ thuộc mạnh.
Năm Tỷ lệ tiêm X (%) Tỷ lệ bệnh Y (%) Số thứ tự bậc d (=X-Y) d2 X Y 1990 55 1,8 10 2 +8 64 91 57 1,7 9 3 +6 36 92 63 2,1 7 1 +6 36 93 64 1,6 6 4 +2 4 94 62 1,2 8 6 +2 4 95 68 1,4 5 5 0 0 96 71 0,9 4 7 -3 9 97 75 0,8 2 8 -6 36 98 74 0,8 3 9 -6 36 99 77 0,6 1 10 -9 81 ∑d2=306 Hệ số liên quan thứ bậc rrange = - 0,85. Điều này nghĩa là tỷ lệ tiêm phòng bằng vaccine và tỷ lệ mắc bệnh có mối tương quan nghịch mạnh. Hay nói cách khác, tiêm vaccine giảm đáng kể tỷ lệ mắc bệnh ở gia cầm”.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng kháng thể
2.3.2.1. Nguyên liệu, bố trí thí nghiệm tiêm vaccine và phương pháp lấy mẫu a/ Nguyên liệu
* Sử dụng các loại vaccine để tiêm chủng phòng bệnh Newcastle cho gà với các quy trình khác nhau, sau đó khảo sát tính đáp ứng miễn dịch của từng quy trình.
- Vaccine Lasota pha với nước sinh lý 0,85%. Nhỏ mắt, mũi, miệng. - Vaccine ND – IB pha với dung dịch kèm theo. Nhỏ mắt, mũi, miệng.
- Vaccine chủng M được pha với nước sinh lý 0,85% đã làm mát với lượng vừa đủ cho mỗi liều là 0,5ml, tiêm dưới da cổ.
* Các loại hóa chất: KH2PO4 (potassium dihydrogen orthophosphate), NaHPO4.2H2O (sodium phosphate monobasic), NaCl (sodium chloride), C72H52O46
(acid tannic), C6H8O7 (acid citric), HCHO (formalin 20%), cồn ethylic...
* Các loại dung dịch: Alsever, chất chống đông máu (Tri-sodium citrate 5%), nước cất, dung dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS) pH 7,2.
* Các dụng cụ cần thiết cho phản ứng như: ống Eppendorf, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, đèn cồn, khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ đáy U, pipet các cỡ, dao, kéo, panh kẹp,...; Các thiết bị: tủ đông, tủ sấy, máy lắc, máy khuấy từ, máy hấp cao áp, máy li tâm, tủ lạnh, nồi hấp ướt, cân điện tử...
* Gà trống có khối lượng khoảng 2,0 - 2,5kg, khỏe mạnh, có phản ứng HI âm tính, để lấy máu dùng chế hồng cầu 1%.
b/ Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quy trình tiêm vaccine đến mức độ miễn dịch ở gà
Gà con 01 ngày tuổi, có nguồn gốc rõ ràng và đảm bảo vệ sinh thú y, được (vây) úm, cho uống nước có bổ sung thêm chất điện giải đầy đủ, chăm sóc, nuôi dưỡng, giám sát thường xuyên. Chủng vaccine phòng bệnh Newcastle theo các giai đoạn tuổi: nhỏ Lasota lần 1 lúc gà 7 ngày tuổi, lặp lại lần 2 lúc 21 ngày tuổi và tiêm vaccine M (Hệ 1) lúc gà 35 ngày tuổi. Sau mỗi lần chủng vaccine toàn đàn gà được quan sát, theo dõi từ 1 - 2 ngày.
Lấy mẫu (30 mẫu) máu để thu huyết thanh vào lúc gà được 21, 28, 35 và 42 ngày tuổi (tương ứng sau chủng Lasota lần 1 là 14 ngày; lần 2 là 7 và 14 ngày; sau tiêm M là 7 ngày. Như vậy ta có thể khảo sát được mức độ miễn dịch dịch thể các Quy trình (QT) chủng vaccine sau:
Quy trình 1: Nhỏ Lasota lúc 7 ngày tuổi, xác định kháng thể vào 21 ngày tuổi; Quy trình 2: Nhỏ Lasota lúc 7 ngày tuổi, lặp lại lúc 21 ngày tuổi và xác định kháng thể vào 28 ngày tuổi;
Quy trình 3: Nhỏ Lasota lúc 7 ngày tuổi, lặp lại lúc 21 ngày tuổi và xác định kháng thể vào 35 ngày tuổi;
Quy trình 4: Nhỏ Lasota lúc 7 ngày tuổi, lặp lại lúc 21 ngày tuổi và tiêm vaccine M lúc 35 ngày tuổi, xác định kháng thể vào 42 ngày tuổi.
Ngoài ra nhằm so sánh, chúng tôi dùng vaccine ND-IB để thay thế Lasota và bố trí chủng cho gà với các Quy trình tương tự, cụ thể Quy trình 3a: Nhỏ ND-IB lúc 7 ngày tuổi, lặp lại lúc 21 ngày tuổi và xác định kháng thể vào 35 ngày tuổi và Quy trình 4a: Nhỏ ND-IB lúc 7 ngày tuổi, lặp lại lúc 21 ngày tuổi và tiêm vaccine M lúc 35 ngày tuổi, xác định kháng thể vào 42 ngày tuổi.
Với 7 đàn gà được bố trí nuôi thực nghiệm theo các địa bàn, hướng nuôi khác nhau để khảo sát đáp ứng miễn dịch sau chủng vaccine theo các quy trình, chúng tôi kí hiệu: Tây Sơn 1 (là đàn gà nuôi tại hộ Đỗ Thanh Lắm, xã Tây An), Tây Sơn 2 (gà nuôi tại hộ Nguyễn Thị Hòa, xã Bình Nghi), Tây Sơn 3 (gà nuôi tại hộ Nguyễn Xuân Ninh, xã Tây Bình), Tây Sơn 4 (gà nuôi tại hộ Lê Trung Trực, xã Tây Vinh) là các đàn gà
nuôi ở Tây Sơn và An Nhơn 1 (gà nuôi tại hộ Nguyễn Anh Kiều, xã Nhơn Khánh), An Nhơn 2 (gà nuôi tại hộ Nguyễn Hữu Độ, xã Nhơn Lộc), An Nhơn 3 (gà nuôi tại hộ Võ Văn Công, xã Nhơn Phong) là các đàn gà nuôi ở An Nhơn, tỉnh Bình Định.
c/ Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
Lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà, với lượng 2ml - 3ml/con. Sau khi lấy máu vào bơm tiêm nhựa, bẻ gập kim, đậy nắp, để nghiêng 30o ở nhiệt độ môi trường khoảng 30 phút cho máu đông tự nhiên rồi cho vào thùng lạnh. Sau khi thu mẫu được đánh dấu, kèm theo danh sách với đầy đủ các chi tiết như: địa điểm, giống, lứa tuổi, ngày tiêm vaccine,... Khi về phòng thí nghiệm mẫu được ly tâm tách lấy huyết thanh và cho vào ống Eppendorf. Mẫu huyết thanh phải được bao gói, bảo quản và vận chuyển trong điều kiện lạnh (từ 2 - 8oC) và gửi đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm. Nếu mẫu chưa được xét nghiệm ngay trong vòng 24 giờ thì được giữ trong tủ âm sâu (-20oC) (Phạm Hồng Sơn, 2009).
Hình 2.2. Lấy mẫu máu thu huyết thanh xét nghiệm d/ Phương pháp pha hóa chất
- Dung dịch sinh lý 0,85% có pH 7,2: Hòa tan 8,5 g NaCl vào trong 1.000ml nước cất, hấp cao áp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
- Chất chống đông: hòa tan 5g Tri-sodium citrate vào 100ml nước cất, hấp cao áp tuyệt trùng ở 121 oC trong vòng 15 phút.
- Hồng cầu gà 1%: Lấy máu gà (khỏe mạnh, phản ứng HI âm tính) vào xi lanh có chứa Tri-sodium citrate 5%. Ly tâm 2000 vòng/phút/10 phút, hút bỏ phần bạch cầu và huyết tương đi rồi cho nước sinh lý vào, trộn đều quay ly tâm loại bỏ phần nước trong phía trên. Làm như thế 3 lần ta thu được hồng cầu. Lấy 1ml hồng cầu pha với 99ml nước sinh lý ta thu được hồng cầu 1%.
2.3.2.2. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Đây là phản ứng chuẩn bị cho phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI), trong đó cần xác định được hiệu giá virus nguyên liệu, để từ đó pha virus nguyên liệu thành dịch virus chuẩn 4HA.
Dựa trên nguyên lý virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, người do trên bề mặt capsid có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu và virus có khả năng bám vào các thụ thể của hồng cầu, làm hồng cầu ngưng kết lại nằm rải rác thành hình mạng nhện dưới đáy ống nghiệm. Sau đó enzyme neuraminidase cắt đứt thụ thể hồng cầu làm hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ (Phạm Hồng Sơn, 2012). Do vậy, ở giai đoạn đầu của phản ứng (ngay sau khi đối chứng âm cho kết quả hồng cầu sa lắng hoàn toàn) mới cho kết quả chính xác.
Chuẩn bị:
+ Hồng cầu gà 1%.
+ Kháng nguyên là virus Newcasle (Lasota), nước sinh lý,.... Phản ứng được tiến hành theo các bước trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các bước phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Nguyên liệu Lỗ (Giếng)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC (-)
Nước sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Kháng nguyên
Newcastle (µl) 25
Độ pha loãng của
dịch virus gốc 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024
Hồng cầu gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Dùng micropipette nhỏ vào tất cả các giếng, mỗi giếng 25µl nước sinh lý. Sau đó cho vào giếng thứ nhất 25µl kháng nguyên Newcastle. Trộn đều rồi hút sang giếng thứ hai 25µl, tiếp tục làm tương tự như vậy cho đến giếng thứ 10 thì hút bỏ đi 25µl. Lúc này hiệu giá kháng nguyên pha loãng từ giếng 1 đến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16;... đến 1/512; 1/1024. Tiếp đó cho vào tất cả các giếng 25µl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ, để yên, đọc kết quả sau khoảng 15 đến 60 phút dựa vào phản ứng âm tính, tức là khi hồng cầu ở lỗ 11 và 12 sa lắng hoàn toàn vào giữa đáy (tâm) lỗ khay.
Phản ứng dương tính: Hồng cầu bị ngưng kết nên không chìm hoặc rải đều thành mảng ở đáy giếng.
trong như ở lỗ đối chứng âm.
Hiệu giá ngưng kết: Đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng trước giếng không ngưng kết.
Hình 2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Hiệu giá phản ứng HA: là độ pha loãng virus cao nhất mà ở đó vẫn còn ngưng kết hồng cầu, người ta gọi đó là 1 đơn vị HA. Trong phản ứng HI phải sử dụng kháng nguyên là virus Newcastlepha ở 4 đơn vị HA, để phản ứng chính xác hơn.
Hình 2.4. Phản ứng thử hiệu giá virus Newcastle
Xác định 4 đơn vị HA: Trên tấm khay vi chuẩn độ (microtest plate) dùng 4 dãy, 4 giếng. Nhỏ vào mỗi giếng 25µl nước sinh lý. Nhỏ vào giếng 1 của 4 dãy: 25µl kháng nguyên đã pha ở 4 đơn vị HA, trộn đều, hút 25µl từ giếng 1 sang giếng 2 và làm tương tự cho tới giếng thứ 3 hút bỏ đi 25µl. Hiệu giá HA của các giếng là: giếng thứ 1 có 2 đơn vị HA, giếng thứ 2 có 1 đơn vị HA, giếng 3 có 0,5 đơn vị HA. Sau đó nhỏ hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, giếng thứ 4 làm đối chứng chỉ có nước sinh lý và
Hồng cầu ngưng kết
Hồng cầu sa lắng
hồng cầu.
Để yên 20 phút rồi đọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xảy ra đến giếng thứ 2 thì kháng nguyên pha đúng ở 4 đơn vị HA.
2.3.2.3. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng này xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh.
Virus Newcastle có thuộc tính ngưng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể tương ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) giúp ta phát hiện được sự hiện diện cũng như bán định lượng virus tương ứng. Đồng thời, người ta còn lợi dụng đặc tính này của virus để xác định sự hiện diện cũng như hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dưới dạng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) (Phạm Hồng Sơn, 2006).
Dựa trên nguyên lý gà mắc bệnh Newcastle hoặc đã được tiêm phòng vaccine Newcastle thì trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu chống lại virus Newcastle, kháng thể trung hòa virus làm nó mất khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà.
Bảng 2.2. Các bước phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Nguyên liệu Giếng
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC (-) ĐC (+)
Nước sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50
Huyết thanh gà (µl) 25
Độ pha loãng của HT 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/216 1/512 1/1024
Kháng nguyên
Newcastle 4HA (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Hồng cầu gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Phản ứng HI cũng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 giếng, mỗi dãy giếng cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số 2. Cho vào mỗi lỗ 25µl nước sinh lý, riêng ô đối chứng (+) cho 50µl nước sinh lý, rồi cho vào giếng thứ nhất 25µl huyết thanh kiểm, trộn đều và hút chuyển sang giếng thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến giếng thứ 10 thì vứt bỏ 25µl. Lúc này hiệu giá huyết thanh pha loãng từ giếng 01 đến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; đến 1/512; 1/1024. Cho vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 11 (đối chứng âm) 25µl dịch virus làm việc 4HA. Sau đó cho vào tất cả các giếng (giếng 1 đến 12) 25µl huyễn dịch hồng cầu đã dùng để
xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12, dùng làm đối chứng âm tính (chỉ chứa virus và hồng cầu) và dương tính (chứa chỉ nước sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dương tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó còn thấy ngăn trở được ngưng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ) (Phạm Hồng Sơn, 2006). Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết không sa lắng hoặc rải đều dưới đáy giếng. Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ (tương tự ở giếng 12 là giếng dương tính giả định chỉ chứa nước sinh lý và hồng cầu), nước bên trong do virus Newcastle bị kháng thể Newcastle trong huyết thanh trung hòa không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
Đọc kết quả phản ứng HI: Phản ứng dương tính thể hiện hồng cầu ở lỗ kiểm chìm xuống đáy lỗ tạo một chấm tròn gần giống ở lỗ12 và tương phản với lỗ thứ 11 là lỗ có hiện tượng ngưng kết rõ: hồng cầu không chìm xuống tâm đáy lỗ mà phân bố đều trong dịch phản ứng. Hiệu giá HI là độ pha loãng huyết thanh cao nhất tại đó kháng thể vẫn còn khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Thông qua hiệu giá HI người ta đánh giá mức độ miễn dịch của đàn gà. Hiệu giá HI từ 4log2 (16 đơn vị HI) trở lên được coi là có khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle. Hiệu giá HI càng cao thì khả năng bảo hộ càng lớn.
2.3.3. Nghiên cứu sự lưu hành của kháng nguyên virus Newcastle
2.3.3.1. Bố trí lấy mẫu
Đối tượng nghiên cứu là quần thể gà ở 20 xã thuộc huyện Tây Sơn và thị xã An Nhơn, tỉnh Bình Định, gồm các vùng, địa hình đặc trưng khác nhau. Gà chăn nuôi nông hộ qui mô nhỏ lẻ tại thời điểm nghiên cứu không được tiêm chủng vaccine, phân gà là nguyên liệu xét nghiệm kháng nguyên duy nhất. Trong mỗi đơn vị lấy 10 xã, mỗi xã lấy ở 3 thôn, tối thiểu 30 mẫu, cụ thể như được nêu ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11 trong