3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1.6.1. Trên thế giới
1.6.1.1. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đang đƣợc phát triển mạnh mẽ trên thế giới do những hiệu quả to lớn của nó trong việc tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, hạ giá thành sản xuất và bảo đảm vệ sinh an toàn sản phẩm. Những loài VK, nấm men nhƣ: L. acidophillus, L. platarum, B. subtilis, B. megaterium, T. faecium, S. boulardii, S. serevisiae,… đã đƣợc phân lập, nuôi cấy và bào chế dƣới dạng chế phẩm vi sinh, probiotic, prebiotic bổ sung vào thức ăn nhằm cải thiện khả năng năng tiêu hóa, hấp thu, nâng cao sức đề kháng và thay thế sử dụng kháng sinh, hóa dƣợc trong thức ăn chăn nuôi (Simon, 2001) [114].
Theo Musa và cs (2009) chế phẩm probiotic đã thúc đẩy sự tăng trƣởng của nhiều loài động vật trong nƣớc, giúp cải thiện hiệu quả tiêu hóa thức ăn, số lƣợng và chất lƣợng của sữa, thịt và trứng. Chế phẩm probiotic bảo vệ động vật chống lại tác nhân gây bệnh, tăng cƣờng khả năng miễn dịch, giảm sử dụng kháng sinh và cho thấy chế phẩm probiotic có chỉ số an toàn cao [98].
Nghiên cứu sử dụng các loài L. acidophilus, S. faecium, phối trộn giữa L. acidophilus với S. faecium, Lactobacillus casei, L. fermentum và L. plantarum trong
thức ăn cho cừu trong thời gian 7 tuần với liều 6x106 CFU/kg (CFU: Colony forming unit) thức ăn để khảo sát sự bài thải E.coli O157 :H7. Kết quả cho thấy hỗn hợp L. cidophilus với S. faecium, L. casei, L. fermentum và L. plantarum đã làm giảm sự bài thải E.coli trong phân (Lema và cs, 2001) [82]. Nghiên cứu của Ezema (2013) đã chứng minh probiotic giúp thúc đẩy tăng trƣởng, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, bảo vệ vật chủ khỏi nhiễm trùng đƣờng ruột và kích thích phản ứng miễn dịch ở động vật trang trại. Chế phẩm sinh học làm tăng sản xuất trứng gà công nghiệp. Năng suất đã tăng đáng kể ở gà thịt và gà tây. Ở động vật nhai lại, chế phẩm sinh học cũng cải thiện tốc độ tăng trƣởng. Tăng cân và hiệu quả sử dụng thức ăn cao hơn là kết quả của các thử nghiệm trên lợn. Tỷ lệ tử vong đặc biệt là do tiêu chảy đã giảm ở lợn [65].
1.6.1.2. Nghiên cứu xử lý phế liệu tôm
Chitin là nguồn tự nhiên đƣợc tái tạo phổ biến nhất sau cellulose và nguồn chính của chitin là phế liệu giáp xác. Chitosan là một dẫn xuất của chitin sau quá trình deacetyl hóa đƣợc sử dụng nhiều trong y tế và thƣơng mại. Vì vậy, đã có nhiều công trình nghiên cứu tách chiết thu nhận chitin và chitosan từ PLT bằng phƣơng pháp hóa học cũng nhƣ sinh học.
Các công trình sử dụng phƣơng pháp hóa học thƣờng với mục đích sản xuất chitin. Với phƣơng pháp này, PLT đƣợc rửa sạch bằng axit sulfuric loãng. Các protein liên kết đƣợc loại bỏ bằng cách rửa dung dịch kiềm có độ bền thấp và sau đó rửa bằng nƣớc. Chitin thô đƣợc xử lý bằng axit clohydric đậm đặc và chitin tinh khiết thu đƣợc sau khi xử lý bằng dung dịch kiềm. Chitosan hòa tan trong nƣớc đã đƣợc chuẩn bị bằng cách thực hiện một quá trình deacetyl hóa bằng cách sử dụng 50% NaOH (w/w) ở 100o
C trong 4-5 giờ và sau đó rửa sạch, sấy khô và nghiền. Islam và cs (2016) đã nghiên cứu tinh chế chitin và chitosan bởi một loạt các thí nghiệm đƣợc tiến hành để tối ƣu hóa mức độ NaOH, nhiệt độ và thời gian khử khoáng và khử protein/deacetyl hóa [75]. Chất lƣợng của chitosan cũng đã đƣợc công bố là phụ thuộc vào các điều kiện của quá trình trích ly bằng hóa học. Kết quả cho thấy 3% HCL và 4% NaOH là nồng độ phù hợp để khử khoáng và khử protein, tƣơng ứng ở nhiệt độ môi trƣờng xung quanh (28 ± 2oC) (Hossain và Iqbal, 2014) [74]. Nghiên cứu của Sadighara và cs (2015) đã mô tả các sắc tố và chiết xuất chitosan từ PLT bằng các phƣơng pháp khác nhau. Trong bƣớc khử protein, sử dụng ba quá trình chiết xuất là axit, kiềm và enzyme. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh có thể thu đƣợc chitosan năng suất cao khi xử lý bằng enzyme [107]. Tokatlı và Demirdöven (2018) đã nghiên cứu và đánh giá các điều kiện sản xuất chitin và chitosan từ PLT bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng. Điều kiện tối ƣu cho sản xuất chitin đƣợc quan sát khi sử dụng HCl 0,73 mol/l trong 132,61 phút ở nhiệt độ phòng để khử khoáng và 0,95 mol/l NaOH trong 75,65 phút ở 60,49oC để khử protein [119]. Ahing và Wid (2016) đã nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ tôm ở Sabah và đánh giá chất lƣợng chitosan thông qua các thông số
bao gồm độ ẩm, độ hòa tan và mức độ deacetyl hóa (DDA) bằng các phƣơng pháp hóa học gồm quá trình khử protein, khử khoáng và deacetyl hóa. Các kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này cho thấy rằng độ ẩm dao động từ 4-7%, trong khi độ hòa tan của chitosan đạt tới 90%. Giá trị DDA thu đƣợc cao dao động từ 70-85% [41].
Việc xử lý PLT bằng phƣơng pháp hóa học chỉ nhằm mục đích thu nhận chitin và chitosan. Phần dịch loại bỏ giàu caroteinoprotein trong các phƣơng pháp này không đƣợc tận dụng đồng thời gây ô nhiễm môi trƣờng.
Chính vì vậy, một số công trình nghiên cứu tách chiết protein và carotenoprotein từ PLT bằng phƣơng pháp sinh học đã đƣợc thực hiện.
Lee và cộng sự (1999) đã so sánh khả năng tách chiết và thu hồi carotenoid có trong chế phẩm caroten-protein bằng phƣơng pháp ủ xi lô axit acetic và phƣơng pháp kết hợp sử dụng dung dịch đệm Na3-EDTA và enzyme protease với mục đích sử dụng làm phẩm màu thực phẩm chức năng. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả tách chiết chế phẩm caroten-protein bằng phƣơng pháp kết hợp sử dụng Na3-EDTA và một loại enzyme protease sinh tổng hợp từ VSV (không ủ xi lô bằng axit) đạt đƣợc là cao hơn [80]. Đặc điểm chung của các enzyme này là có khoảng pH thích hợp rộng, thƣờng từ 5,5 - 8,5; vì vậy, khi ứng dụng thủy phân thì có thể thích ứng với pH môi trƣờng tự nhiên của nguyên liệu thủy sản mà không cần điều chỉnh pH. Nhiệt độ thích hợp của các enzyme này dao động trong khoảng từ 35 – 50oC. Sử dụng protease sẽ phá vỡ các liên kết của các protein khác trong PLT, do đó làm giảm sự kết tủa protein tại điểm đẳng điện pI và làm tăng khả năng thu hồi caroten-protein (Dauphin, 1991)[64].
Armenta-López và cs (2002) đã nghiên cứu trích ly astaxanthin từ PLT bằng cách lên men lactic và thủy phân bằng enzyme phức hợp carotenoprotein. PLT đƣợc nuôi cấy với VK Lactobacillus, sau đó carotenoid đƣợc chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ. Tách phức hợp protein – sắc tố đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng hỗn hợp 4 enzyme thƣơng mại và protein đƣợc tách khỏi sắc tố bằng phƣơng pháp siêu lọc [48]. Carotenoprotein đã đƣợc ứng dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản nhƣ tạo màu cho thịt cá, tăng hệ miễn dịch, giảm stress (Pan và cs, 2003) [101]. Kết quả nghiên cứu của Amar và cs (2001) cho thấy astaxanthin giúp cải thiện màu sắc thịt cá Hồi vân sau 9 tuần nuôi [42]. Nghiên cứu của Bell và cs (2000) về sự biến đổi màu sắc cơ thịt cá Hồi Đại Tây Dƣơng khi bổ sung astaxanthin cũng cho biết màu sắc cơ thịt cá thay đổi rõ rệt sau 12 tuần nuôi [50]. Sowmya và cs (2011) đã nghiên cứu sử dụng protease của đầu tôm để thu hồi carotenoprotein với hoạt động chống oxy hóa cao. Hoạt tính protease cao nhất trích ly bằng dung dịch đệm ở pH 8,0 (9,85 ± 0,61 đơn vị). Hoạt tính protease tăng lên với nhiệt độ lên đến 50oC với hoạt độ cao nhất là 19,32 ± 2.0 đơn vị và giảm sau đó. Do đó, việc tự phân hủy tôm để thu hồi carotenoprotein đƣợc thực hiện ở pH 8,0 và ở 50oC. Điều kiện tối ƣu để có hoạt tính chống oxy hóa giàu carotenoprotein từ đầu tôm đã đƣợc xác định là chất thải và đệm (pH 8.0) tỷ lệ 1:
5 và thời gian phân hủy 2 giờ ở 50oC [116]. Theo nghiên cứu của Arbia và cs (2013) phƣơng pháp mới sử dụng VK lactic hoặc VK phân giải protein đã đƣợc sử dụng để chiết xuất chitin. Phƣơng pháp này cho phép tạo ra chất lƣợng chitin tốt và tận dụng đƣợc phần chất lỏng giàu protein có thể đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và động vật, ngoài ra phƣơng pháp này còn tạo ra sắc tố, chủ yếu là astaxanthin [46]. Sila và cs (2014) đã nghiên cứu các đặc tính sinh hóa và chống oxy hóa của carotenoprotein từ PLT bằng thủy phân enzyme. Thành phần, tính chất chức năng và hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của phần peptide của carotenoprotein từ PLT (Parapenaeus longirostris) đƣợc tạo ra bằng cách xử lý enzyme alcalase. Phần peptide của carotenoprotein (PFCP) chứa 80,8 ± 0,21% protein, 2,74 ± 0,3% lipid, 14,4 ± 0,14% tro, 1,13 ± 0,08% chitin và 1,08 ± 0,02 μg tổng số carotenoid/g mẫu. Cấu trúc amino acid của PFCP cho thấy các amino acid thiết yếu có tỷ lệ cao nhƣ arginine, lysine, histidine và leucine. Do đó, PFCP có giá trị dinh dƣỡng cao và có thể đƣợc sử dụng nhƣ một chất bổ sung protein cho các chế độ ăn uống kém cân bằng. Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy phần peptide của carotenoproteins là một chất chống oxy hóa tự nhiên [113]. Senphan và cs (2014) đã nghiên cứu đặc điểm và hoạt động chống oxy hóa của carotenoprotein chiết xuất từ vỏ tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dƣơng bằng cách sử dụng protease gan tụy. Kết quả nghiên cứu cho thấy carotenoprotein bao gồm 73,58% protein, 21,87% lipit và 2,63% hàm lƣợng tro và có thể sử dụng làm thực phẩm bổ sung dinh dƣỡng hoặc nhƣ thức ăn chăn nuôi [112]. Ngoài ra, carotenoid cũng đƣợc dùng trong công nghiệp thực phẩm do chúng có khả năng chống oxy hóa, kích thích hệ thống miễn dịch, kích thích tăng khả năng sinh trƣởng và sinh sản. Nó còn có thể giúp làm giảm stress và ngăn ngừa một số bệnh thoái hóa cơ thể nhƣ chứng xơ vữa động mạch, ung thƣ và các bệnh về mắt (Britton, 1995; Mayne, 1996; Chien và cs, 2003; Higuera và cs, 2006; Khanafari và cs, 2007) [54],[59],[71],[78],[90].
Phƣơng pháp sinh học để chiết xuất chitin từ PLT là một kỹ thuật tiên tiến và mới trong đó chitin đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng VK lactic và sản phẩm tạo ra có chất lƣợng tốt. Kỹ thuật thân thiện với môi trƣờng và chi phí thấp này đòi hỏi 24 - 48 giờ cấy Lactobacillus để lên men. Cấy 10% chủng để lên men với PLT cùng với lƣợng carbon đƣợc ủ trong 180 giờ, tiếp theo là lọc và chitin đƣợc sấy khô bằng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là sản phẩm của chất lỏng giàu protein và có thể đƣợc sử dụng cho thức ăn cho ngƣời và động vật (Pal và cs, 2014) [100]. Messina và cs (2014) đã đánh giá mức độ thủy phân sau quá trình thủy phân PLT đƣợc thực hiện bởi ba enzyme protease thƣơng mại là Protamex, Flavourzyme và Alcalase. Hơn nữa để thu hồi astaxanthin từ chất thải tôm khô, sử dụng dung môi hữu cơ và siêu tới hạn CO2. Năng suất chiết (µg/g) giữa hai phƣơng pháp đƣợc sử dụng ở đây đƣợc so sánh thông qua phân tích quang phổ. Giữa các protease đƣợc sử dụng, Protamex có DH% cao nhất. Kết quả hexane/ isopropanol là dung môi tốt nhất để chiết astaxanthin [91].
1.6.2. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu trong nƣớc đã đóng góp tích cực vào việc cải thiện tình hình chăn nuôi. Tìm ra những chế phẩm mới có công dụng trong chăn nuôi gia cầm, gia súc, thủy sản… Theo Nguyễn Tiến Toàn và Đỗ Văn Ninh (2013) khi bổ sung 0,6% probiotic trong khẩu phần thức ăn giúp tăng tốc độ sinh trƣởng của gà lên 4% và hệ số tiêu thụ thức ăn trên 1 kg tăng trọng giảm 9,8% [30]. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra tiềm năng sử dụng lysine và probiotics trong khẩu phần thức ăn cho gà nuôi thƣơng phẩm để cải thiện tốc độ sinh trƣởng, hiệu quả chuyển hóa thức ăn và chất lƣợng thịt. Lê Văn An và cs (2017) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic (B. subtilis và L. plantarum) trong khẩu phần thức ăn giai đoạn nuôi lợn sau cai sữa và nuôi thịt [1].
VK lactic và VK Bacillus là những VK có đặc tính probiotic đƣợc sử dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học cho ngƣời và động vật. Từ các mẫu đất ao nuôi tôm, phân giun làm thức ăn nuôi tôm, từ đƣờng tiêu hóa của tôm, Khuất Hữu Thanh và cs (2009) đã phân lập đƣợc 60 chủng VK lactic và Bacillus. Trong đó 18/32 chủng VK lactic và 12/28 chủng VK Bacillus có hoạt tính đối kháng VK Vibrio và VK kiểm định. Nghiên cứu đã xác định trình tự 16 S rRNA của các chủng LPG 5, LRT8, BaD và BaRT. Chủng LPG 5 tƣơng đồng 100% với L. acidophilus strain LH5, chủng LRT8 tƣơng đồng 98% với L. helveticus strain IMAU40107, chủng BaD tƣơng đồng 100% với B. subtilis strain EBS05, chủng BaRT tƣơng đồng 97% với Bacillus sp.
strain RSP-GLU. Chế phẩm probiotic tạo đƣợc có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống tăng khoảng 15%, trọng lƣợng tôm 120 ngày tuổi tăng khoảng 13% so với đối chứng [22].
Hiện nay ở Việt Nam, phần lớn các nhà sản xuất chitin và chitosan đều sử dụng phƣơng pháp hóa học. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này không những không tận dụng đƣợc phần chất lỏng carotenoprotein, mà ngƣợc lại phần này sẽ bị loại bỏ cùng với hóa chất gây ô nhiễm môi trƣờng. Để khắc phục đƣợc vấn đề trên đã có một số công trình nghiên cứu về việc xử lý PLT bằng phƣơng pháp sinh học. Trang Sĩ Trung (2008) đã đánh giá chất lƣợng sản phẩm và hiệu quả về mặt môi trƣờng của quy trình sản xuất chitin từ PLT đƣợc thực hiện bằng cách kết hợp xử lý enzyme và thu hồi chitin cùng với hỗn hợp protein và astaxanthin trong quy trình. Quy trình cải tiến có nhiều ƣu điểm nhƣ thu hồi lƣợng chất khô trong phế liệu tăng lên khoảng 20%. Chitin, chitosan thu đƣợc có chất lƣợng cao hơn, đặc biệt là độ nhớt so với phƣơng pháp hóa học truyền thống. Hỗn hợp protein và astaxanthin thu đƣợc có chất lƣợng cao, có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc. Ngoài ra, nƣớc thải của quy trình cải tiến có hàm lƣợng chất lơ lửng thấp, giảm hơn 90%, BOD giảm 50%, COD giảm hơn 30% so với nƣớc thải của phƣơng pháp hóa học không thu hồi protein [35].
Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Đan Phƣợng và cs (2008) cho thấy carotenoprotein có thành phần chủ yếu là protein (khoảng 55%), khoáng, chitin và astaxanthin [18]. Trong đó, carotenoprotein có chứa một lƣợng caroten, cụ thể là astaxanthin với hàm lƣợng lên đến trên 140 mg/kg. Vì astaxanthin là một chất có hoạt tính sinh học cao, có nhiều ứng dụng trong thức ăn thủy sản (Kittikaiwan và cs, 2007) [79]. Về ảnh hƣởng của phƣơng pháp xử lý loại nƣớc bằng sấy ở nhiệt độ thấp và phơi nắng, kết quả cho thấy sấy ở nhiệt độ 35oC thì không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng bột carotenoprotein, thể hiện rất rõ ở hàm lƣợng astaxanthin còn lại so với phƣơng pháp sấy đông khô (đối chứng). Ngƣợc lại, làm khô bằng phơi nắng ảnh hƣởng rất lớn đến hàm lƣợng astaxanthin. Sự tác động xấu do phơi nắng xảy ra vì astaxanthin rất dễ bị phân hủy dƣới tác dụng của nhiệt và ánh sáng.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Đan Phƣợng và cs (2008), carotenoprotein ở dạng bột nhão có hàm lƣợng nƣớc cao trên 69% thu nhận từ quá trình chế biến chitin đƣợc xử lý thành dạng bột khô với độ ẩm 13-14%. Phƣơng pháp tách nƣớc bột carotenoprotein thích hợp là sấy ở nhiệt độ 35oC [18]. Bột carotenoprotein sau khi xử lý chứa trên 58% protein với đầy đủ các amino acid thiết yếu, 5% chitin, và khoảng 14% khoáng và một lƣợng astaxanthin đáng kể. Theo nghiên cứu của Trang Sĩ Trung và cs (2009) dịch ủ thu hồi theo phƣơng pháp ủ xi lô có màu sắc đẹp, mùi thơm đặc trƣng, chứa nhiều thành phần có giá trị nhƣ protein, khoáng, lipid, đặc biệt có chứa astaxanthin. Hơn nữa, dịch ủ có gần nhƣ đầy đủ các acid amin đặc biệt là các acid amin thiết yếu. Kết quả trên cho thấy dịch ủ là một nguồn nguyên liệu có giá trị để ứng dụng trong phối trộn sản xuất thức ăn cao đạm cho nuôi trồng thủy sản hoặc sử dụng trực tiếp phối chế cho thức ăn gia súc, gia cầm [36]. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cs (2018) cho thấy màu sắc cơ thịt của cá Hồi vân trong nuôi thƣơng