3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh
2.3.1.1. Phương pháp cấy tăng sinh
Khuẩn lạc VK sau 24 giờ nuôi cấy đƣợc cấy vào 1 ml môi trƣờng lỏng. Chủng
B. subtilis C10 đƣợc cấy vào môi trƣờng có chứa cao thịt và pepton, thực hiện nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở 35oC, 24 giờ. Chủng L. fermentum TC10 đƣợc cấy vào môi trƣờng MRS không lắc ở 35oC, 24 giờ.
2.3.1.2. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận sinh khối tế bào
Dịch nuôi cấy tăng sinh (500 l) đã thu nhận ở mục 2.3.1.1 tiếp tục đƣợc cho vào bình tam giác chứa 20 ml môi trƣờng cao thịt và pepton thực hiện nuôi cấy trên máy lắc theo chế độ trên đối với B. subtilis C10. 500 l dịch tăng sinh của chủng L. fermentum TC10 đƣợc cấy vào 20 ml môi trƣờng MRS và nuôi cấy nhƣ điều kiện nuôi cấy tăng sinh.
2.3.1.3. Xác định số tế bào sống trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
* Xác định số lƣợng tế bào sống đối với VK lactic (TCVN 4884:2005) [21]
Mẫu thí nghiệm có chứa tế bào VSV đƣợc đồng hóa và pha loãng thập phân. 1 ml dịch pha loãng thích hợp đƣợc cho vào đĩa petri vô trùng và trộn với môi trƣờng MRS agar 43oC. Sau khi lớp môi trƣờng thứ nhất đông, lớp môi trƣờng MRS agar thứ hai đƣợc đổ lên cho đến khi kín bề mặt. Số lƣợng tế bào sống đƣợc xác định bằng cách đếm số khuẩn lạc phát triển trên các đĩa có số lƣợng nằm trong khoảng 50 – 250 sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ. Tổng số VK lactic trong 1 ml mẫu thử đƣợc tính theo công thức:
𝑁 = 𝐿𝑜𝑔
Trong đó, N: Tổng số VK sống có trong 1 ml mẫu thử (CFU/ml), ∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa đã chọn; V: Thể tích cấy trên mỗi đĩa (ml); n1: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất đƣợc giữ lại; n2: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai đƣợc giữ lại; d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất
* Xác định số lƣợng tế bào sống đối với VK B. subtilis
Mẫu thí nghiệm có chứa tế bào VSV đƣợc đồng hóa và pha loãng thập phân. 0,1 ml của độ pha loãng thích hợp đƣợc dàn đều trên đĩa thạch có chứa môi trƣờng thạch thịt-pepton. Số tế bào sống đƣợc xác định nhƣ đối với VK lactic.