3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4.1. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease
Thời gian là một trong những yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình thuỷ phân và lên men PLT. Thời gian quá ngắn không đủ để enzyme protease hoạt động, hiệu quả thủy phân thấp. Việc kéo dài thời gian thủy phân là nguyên nhân làm cho nguyên liệu chuyển sang giai đoạn amino acid bị phân hủy, tạo ra mùi hôi thối, làm giảm chất lƣợng của sản phẩm. Chính vì vậy, việc xác định thời gian thích hợp để thủy phân và lên men PLT là điều kiện cần thiết đƣợc quan tâm.
Để xác định thời gian sinh hoạt độ protease cao nhất, chúng tôi tiến hành bổ sung 6% sinh khối B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với tỷ lệ 1:2 vào môi trƣờng PLT có bổ sung 5,2% bột sắn thô đã hấp tiệt trùng. Theo kết quả nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis C10, thời gian hoạt độ enzyme này trong môi trƣờng đạt cực đại là 24 giờ (Đỗ Thị Bích Thủy, 2008) [24]. Vì vậy trong thí nghiệm này, hỗn hợp đƣợc lên men ở nhiệt độ 35o
C, mẫu phân tích đƣợc lấy ở các mốc thời gian 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ và 72 giờ. Sau từng mức thời gian lên men, dịch lỏng thu đƣợc sau khi tách bã đƣợc xác định hoạt độ protease bằng phƣơng pháp Ason cải tiến. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt độ protease
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Biểu đồ hình 3.11 thể hiện sự tác động đáng kể của thời gian lên men đến hoạt độ protease từ dịch thủy phân. Hoạt độ protease tăng mạnh sau 8 giờ, 16 giờ lên men và đạt giá trị cực đại sau 24 giờ lên men (52,03 UI/ml). Sau 24 giờ, hoạt độ protease trong môi trƣờng bắt đầu giảm dần (Hình 3.11).
Tại các thời điểm trƣớc khi nuôi cấy 8 giờ, hoạt độ protease hầu nhƣ bằng 0, có lẽ trong giai đoạn này VK làm quen với môi trƣờng và phát triển sinh khối. Khi thời gian lên men tăng từ 24 đến 72 giờ, hoạt độ protease giảm từ 52,03 (UI/ml) xuống 42,46 (UI/ml). Do trong thời gian đầu, trong môi trƣờng còn đầy đủ chất dinh dƣỡng đảm bảo cho VK sinh trƣởng tốt. Sau một thời gian sinh trƣởng thì mật độ tế bào trong môi trƣờng lúc này bắt đầu tăng lên và đồng thời lƣợng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cũng bắt đầu giảm. Chính vì thế, để tồn tại VK tiết ra enzyme để phân giải cơ chất đáp ứng nhu cầu sử dụng của chúng nên tại thời điểm này hoạt độ enzyme bắt đầu tăng mạnh. Khi môi trƣờng đã cạn kiệt chất dinh dƣỡng thì khả năng sinh trƣởng của chúng cũng bắt đầu giảm, điều này kéo theo lƣợng enzyme do nó tiết ra cũng giảm theo. Thời gian lên men cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Tuy nhiên, thời gian thủy phân càng kéo dài khi cơ chất đã hết thì các sản phẩm của quá trình thủy phân tiếp tục phân cắt làm giảm hiệu suất thủy phân (See và cs, 2011) [111]. Sự giảm hoạt độ protease trong môi trƣờng nuôi cấy có thể đƣợc giải thích bởi nhiều lý do khác nhau: Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, do ảnh hƣởng của pH và thành phần môi trƣờng thay đổi do sự hình thành các hợp chất mới của quá trình trao đổi chất của VK, hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng giảm... làm cho tế bào VK suy thoái, enzyme bị bất hoạt. Hơn nữa đối với protease còn xảy ra hiện tƣợng enzyme tự thủy phân làm cho PA giảm.