3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.2. Phƣơng pháp hóa sinh
2.3.2.1. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Ason cải tiến
Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 đƣợc ủ ở 30oC, 10 phút; phản ứng đƣợc kết thúc bằng cách cho dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch axit cho 1 thể tích enzyme vào hỗn hợp phản ứng; dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Mẫu kiểm tra đƣợc thực hiện đồng thời bằng cách cho dung dịch tricloacetic acid (TCA) vào enzyme trƣớc khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu đƣợc sau phản ứng đƣợc đo trên máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 750 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine, để tính sản phẩm tạo thành tƣơng ứng dƣới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease (HP) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme mà trong một phút ở 30o
C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong (TCA), cho phản ứng màu tƣơng đƣơng với 1,0 µmol tyrosine (Mukherjee và cs., 2008) [97].
2.3.2.2. Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Protein trong mẫu sau khi đƣợc vô cơ hóa bởi H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác là hỗn hợp K2SO4: CuSO4 (10:1) tạo thành NH3. NH3 tiếp tục tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Dùng kiềm mạnh NaOH đẩy NH3 từ (NH4)2SO4. NH3 đƣợc hấp thu bởi H3PO3 tạo thành (NH4)2P4O7 (amoni tetraborat). Định lƣợng muối amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt với chất chỉ thị tasiro (AOAC,1995) [44].
2.3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ formol bằng phương pháp Sorensen
Đối với các acid amin dicarboxylic (acid glutamic, acid aspatic, …) phải trung hòa trƣớc nhóm carboxylic tự do đến pH = 7. Khi dùng phƣơng pháp Sorensen, ta thƣờng chuẩn độ NaOH đến màu đỏ thắm để đảm bảo kết thúc định phân nằm trong khoảng pH = 9,1 – 9,6. Trong điều kiện này, ta coi số nhóm –COOH (không tính các nhóm carboxylic tự do) đƣợc chuẩn độ chính là số phân tử acid amin trong mẫu. Do khó nhận biết lúc chuyển màu nên thƣờng dùng dung dịch màu tiêu chuẩn nhƣ sau: lấy 100 ml Na2HPO4 0,1N và cho thêm 0,5 ml phenophtaletin 0,1% (AOAC, 1996) [43].
Chuẩn bị dung dịch mẫu:
- Dùng pipet lấy chính xác 10 ml (Vm) cho vào bình định mức 100 ml, cho nƣớc cất đến vạch định mức.
Trung hòa mẫu:
- Dùng pipet lấy chính xác 20 ml (V’) dung dịch mẫu cho vào bình nón dung tích 250 ml, cho tiếp 2 ml phenolphthalein 0,5%, 20 ml nƣớc cất, trung hòa dung dịch với NaOH 0,1N nếu mẫu có tính acid đến màu hồng nhạt hoặc với HCl 0,1N nếu mẫu có tính base đến không màu và lấy lại màu hồng nhạt bằng vài giọt NaOH 0,1N.
Chuẩn độ:
- Chuẩn độ dung dịch đã trung hòa bằng NaOH 0,1N từ màu hồng nhạt sang màu hồng.
- Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (pH = 9,1). - Cho 10ml formol trung hòa dung dịch sẽ mất màu, chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi có màu hồng nhạt (pH = 8,3).
- Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (giống màu tiêu chuẩn) (pH = 9,6).
Tính kết quả:
X= (V.0,0028.100.Vo)/(Vm.V’)(g/l)
Trong đó: V: Số ml NaOH 0,2N tiêu tốn để chuẩn độ
0,0028: Lƣợng nito tƣơng ứng với 1 ml NaOH 0,2N (g)
2.3.2.4. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Nguyên tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ở bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao.
Quy trình thực hiện: Lấy khoảng 20 µl đến 40 µl dịch chiết trộn với nƣớc cất để đạt thể tích là 30 ml. Sau đó thêm vào 1ml dung dịch DPPH 0,2 nM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Đo độ hấp thu quang học ở bƣớc sóng 517 nm (Blois, 1958) [52].
2.3.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng astaxanthin trong phế liệu tôm
Hàm lƣợng astaxanthin trong đầu tôm đƣợc phân tích theo phƣơng pháp của Metusalach (1997) và Tolasa và cộng sự (2005) [92],[120]. Mẫu cần phân tích (1g) đƣợc cho vào ống đồng hóa. Dung môi chứa hexan và isopropanol với tỷ lệ 3:2 (v:v) (5 mL) đƣợc cho vào ống đồng hóa cps chứa mẫu. Quá trình đồng hóa mẫu đƣợc thực hiện trong 2 phút với tốc độ 15000 vòng/phút. Sau khi đồng hóa, mẫu đƣợc để yên 30 phút. Dịch chiết thu đƣợc sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1 (quá trình này đƣợc thực hiện 3 lần) đƣợc cho vào bình chiết có bổ sung thêm nƣớc muối sinh lý
với tỷ lệ 1:2 và lắc nhẹ, sau đó để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để tách pha hoàn toàn. Pha trên có chứa astaxanthin đƣợc rửa bằng nƣớc muối sinh lý, sau đó loại bỏ hexan bằng cách cô quay chân không ở 40oC. Mẫu thu đƣợc đƣợc pha với ete dầu mỏ và định mức lên 10 ml đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 468 nm (A468), dùng eter dầu mỏ làm dung dịch so sánh.
Hàm lƣợng astaxanthin tổng số trong mẫu đƣợc tính theo công thức của Saito và Regier (1971): C(μg/g mẫu) = (g) Trong đó: C: là hàm lƣợng astaxanthin (µg/g mẫu). A: độ hấp thụ của dung dịch ở 468 nm. V: thể tích pha loãng (ml). D: hệ số pha loãng. G: trọng lƣợng mẫu khô (g).
0,2: là độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 468 nm của 1 µg/ml astaxanthin chuẩn.