3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu
- Tất cả các thí nghiệm của đề tài đƣợc tiến hành ở Phòng thí nghiệm khoa Cơ khí Công nghệ, Trƣờng Đại học Nông Lâm, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Huế và Trung tâm ứng dụng tiến bộ Khoa học Công nghệ Quảng trị.
- Thời gian: từ tháng 11/2017 đến tháng 08/2018.
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu
PLT đƣợc cung cấp bởi Công ty Cổ Phần Chăn Nuôi C.P Việt Nam - Chi Nhánh Đông Lạnh Thừa Thiên Huế. Yêu cầu phế liệu phải tƣơi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Phế liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nƣớc đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Phế liệu trƣớc khi sử dụng đƣợc rửa sạch, để ráo trong thời gian 5 phút. Trong trƣờng hợp chƣa làm ngay thì rửa sạch, bao gói và bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC.
Chủng B. subtilis C10 đƣợc phân lập từ PLT và có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao (Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô, 2004) [28].
L. fermentum TC10 đƣợc phân lập từ tôm chua và có tiềm năng probiotic cao (Đỗ Thị Bích Thủy, 2014) [25].
Bã sắn khô đƣợc cung cấp bởi Công ty Cổ phần FOCOCEV VIỆT NAM – Nhà máy tinh bột sắn Thừa Thiên Huế (hàm lƣợng tinh bột: 40- 50%, độ ẩm: 10-16%, chất xơ: 14-20%, tạp chất: 1% max).
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
(1). Phân tích thành phần hóa học của PLT
(2). Nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein (3). Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
(4). Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
(5). Nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu ở trên, chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp nghiên cứu nhƣ sau:
2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh
2.3.1.1. Phương pháp cấy tăng sinh
Khuẩn lạc VK sau 24 giờ nuôi cấy đƣợc cấy vào 1 ml môi trƣờng lỏng. Chủng
B. subtilis C10 đƣợc cấy vào môi trƣờng có chứa cao thịt và pepton, thực hiện nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở 35oC, 24 giờ. Chủng L. fermentum TC10 đƣợc cấy vào môi trƣờng MRS không lắc ở 35oC, 24 giờ.
2.3.1.2. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận sinh khối tế bào
Dịch nuôi cấy tăng sinh (500 l) đã thu nhận ở mục 2.3.1.1 tiếp tục đƣợc cho vào bình tam giác chứa 20 ml môi trƣờng cao thịt và pepton thực hiện nuôi cấy trên máy lắc theo chế độ trên đối với B. subtilis C10. 500 l dịch tăng sinh của chủng L. fermentum TC10 đƣợc cấy vào 20 ml môi trƣờng MRS và nuôi cấy nhƣ điều kiện nuôi cấy tăng sinh.
2.3.1.3. Xác định số tế bào sống trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
* Xác định số lƣợng tế bào sống đối với VK lactic (TCVN 4884:2005) [21]
Mẫu thí nghiệm có chứa tế bào VSV đƣợc đồng hóa và pha loãng thập phân. 1 ml dịch pha loãng thích hợp đƣợc cho vào đĩa petri vô trùng và trộn với môi trƣờng MRS agar 43oC. Sau khi lớp môi trƣờng thứ nhất đông, lớp môi trƣờng MRS agar thứ hai đƣợc đổ lên cho đến khi kín bề mặt. Số lƣợng tế bào sống đƣợc xác định bằng cách đếm số khuẩn lạc phát triển trên các đĩa có số lƣợng nằm trong khoảng 50 – 250 sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ. Tổng số VK lactic trong 1 ml mẫu thử đƣợc tính theo công thức:
𝑁 = 𝐿𝑜𝑔
Trong đó, N: Tổng số VK sống có trong 1 ml mẫu thử (CFU/ml), ∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa đã chọn; V: Thể tích cấy trên mỗi đĩa (ml); n1: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ nhất đƣợc giữ lại; n2: Số đĩa của đậm độ pha loãng thứ hai đƣợc giữ lại; d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng thứ nhất
* Xác định số lƣợng tế bào sống đối với VK B. subtilis
Mẫu thí nghiệm có chứa tế bào VSV đƣợc đồng hóa và pha loãng thập phân. 0,1 ml của độ pha loãng thích hợp đƣợc dàn đều trên đĩa thạch có chứa môi trƣờng thạch thịt-pepton. Số tế bào sống đƣợc xác định nhƣ đối với VK lactic.
2.3.2. Phƣơng pháp hóa sinh
2.3.2.1. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Ason cải tiến
Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 đƣợc ủ ở 30oC, 10 phút; phản ứng đƣợc kết thúc bằng cách cho dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch axit cho 1 thể tích enzyme vào hỗn hợp phản ứng; dịch nổi thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Mẫu kiểm tra đƣợc thực hiện đồng thời bằng cách cho dung dịch tricloacetic acid (TCA) vào enzyme trƣớc khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu đƣợc sau phản ứng đƣợc đo trên máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 750 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine, để tính sản phẩm tạo thành tƣơng ứng dƣới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease (HP) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme mà trong một phút ở 30o
C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong (TCA), cho phản ứng màu tƣơng đƣơng với 1,0 µmol tyrosine (Mukherjee và cs., 2008) [97].
2.3.2.2. Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Protein trong mẫu sau khi đƣợc vô cơ hóa bởi H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác là hỗn hợp K2SO4: CuSO4 (10:1) tạo thành NH3. NH3 tiếp tục tác dụng với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Dùng kiềm mạnh NaOH đẩy NH3 từ (NH4)2SO4. NH3 đƣợc hấp thu bởi H3PO3 tạo thành (NH4)2P4O7 (amoni tetraborat). Định lƣợng muối amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt với chất chỉ thị tasiro (AOAC,1995) [44].
2.3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ formol bằng phương pháp Sorensen
Đối với các acid amin dicarboxylic (acid glutamic, acid aspatic, …) phải trung hòa trƣớc nhóm carboxylic tự do đến pH = 7. Khi dùng phƣơng pháp Sorensen, ta thƣờng chuẩn độ NaOH đến màu đỏ thắm để đảm bảo kết thúc định phân nằm trong khoảng pH = 9,1 – 9,6. Trong điều kiện này, ta coi số nhóm –COOH (không tính các nhóm carboxylic tự do) đƣợc chuẩn độ chính là số phân tử acid amin trong mẫu. Do khó nhận biết lúc chuyển màu nên thƣờng dùng dung dịch màu tiêu chuẩn nhƣ sau: lấy 100 ml Na2HPO4 0,1N và cho thêm 0,5 ml phenophtaletin 0,1% (AOAC, 1996) [43].
Chuẩn bị dung dịch mẫu:
- Dùng pipet lấy chính xác 10 ml (Vm) cho vào bình định mức 100 ml, cho nƣớc cất đến vạch định mức.
Trung hòa mẫu:
- Dùng pipet lấy chính xác 20 ml (V’) dung dịch mẫu cho vào bình nón dung tích 250 ml, cho tiếp 2 ml phenolphthalein 0,5%, 20 ml nƣớc cất, trung hòa dung dịch với NaOH 0,1N nếu mẫu có tính acid đến màu hồng nhạt hoặc với HCl 0,1N nếu mẫu có tính base đến không màu và lấy lại màu hồng nhạt bằng vài giọt NaOH 0,1N.
Chuẩn độ:
- Chuẩn độ dung dịch đã trung hòa bằng NaOH 0,1N từ màu hồng nhạt sang màu hồng.
- Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (pH = 9,1). - Cho 10ml formol trung hòa dung dịch sẽ mất màu, chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi có màu hồng nhạt (pH = 8,3).
- Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N từ màu hồng sang màu đỏ thắm (giống màu tiêu chuẩn) (pH = 9,6).
Tính kết quả:
X= (V.0,0028.100.Vo)/(Vm.V’)(g/l)
Trong đó: V: Số ml NaOH 0,2N tiêu tốn để chuẩn độ
0,0028: Lƣợng nito tƣơng ứng với 1 ml NaOH 0,2N (g)
2.3.2.4. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Nguyên tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ở bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao.
Quy trình thực hiện: Lấy khoảng 20 µl đến 40 µl dịch chiết trộn với nƣớc cất để đạt thể tích là 30 ml. Sau đó thêm vào 1ml dung dịch DPPH 0,2 nM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Đo độ hấp thu quang học ở bƣớc sóng 517 nm (Blois, 1958) [52].
2.3.2.5. Phương pháp phân tích hàm lượng astaxanthin trong phế liệu tôm
Hàm lƣợng astaxanthin trong đầu tôm đƣợc phân tích theo phƣơng pháp của Metusalach (1997) và Tolasa và cộng sự (2005) [92],[120]. Mẫu cần phân tích (1g) đƣợc cho vào ống đồng hóa. Dung môi chứa hexan và isopropanol với tỷ lệ 3:2 (v:v) (5 mL) đƣợc cho vào ống đồng hóa cps chứa mẫu. Quá trình đồng hóa mẫu đƣợc thực hiện trong 2 phút với tốc độ 15000 vòng/phút. Sau khi đồng hóa, mẫu đƣợc để yên 30 phút. Dịch chiết thu đƣợc sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1 (quá trình này đƣợc thực hiện 3 lần) đƣợc cho vào bình chiết có bổ sung thêm nƣớc muối sinh lý
với tỷ lệ 1:2 và lắc nhẹ, sau đó để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để tách pha hoàn toàn. Pha trên có chứa astaxanthin đƣợc rửa bằng nƣớc muối sinh lý, sau đó loại bỏ hexan bằng cách cô quay chân không ở 40oC. Mẫu thu đƣợc đƣợc pha với ete dầu mỏ và định mức lên 10 ml đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 468 nm (A468), dùng eter dầu mỏ làm dung dịch so sánh.
Hàm lƣợng astaxanthin tổng số trong mẫu đƣợc tính theo công thức của Saito và Regier (1971): C(μg/g mẫu) = (g) Trong đó: C: là hàm lƣợng astaxanthin (µg/g mẫu). A: độ hấp thụ của dung dịch ở 468 nm. V: thể tích pha loãng (ml). D: hệ số pha loãng. G: trọng lƣợng mẫu khô (g).
0,2: là độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 468 nm của 1 µg/ml astaxanthin chuẩn.
2.3.3. Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy đến khối lƣợng không đổi. Mẫu đƣợc sấy ở 103 2oC trong 2 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng. Sấy mẫu thêm 30 phút, làm nguội và cân để kiểm tra khối lƣợng không đổi.
- Tính kết quả: % 100 . 1 2 1 m m m X Trong đó: X : độ ẩm của mẫu (%).
m1: khối lƣợng của mẫu trƣớc khi sấy (g). m2: khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g).
2.3.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu
2.3.4.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.1 (TN1).
Bã chitin Làm nguội (nhiệt độ phòng)
Lên men PLT ở 35oC trong 48 giờ
Lọc loại bỏ bã Dịch carotenoprotein Phế liệu tôm (100g) Hấp tiệt trùng (121oC, 20 phút) Bột sắn (5,2g) Phối trộn Xay nhỏ (3-5mm) B. subtilis C10 Phối trộn theo các tỷ lệ (1:1, 1:2, 2:1 và ĐC) L. fermentum TC10 Nƣớc (100ml) Phân tích các chỉ tiêu Mật độ tế bào sống Kháng oxy hóa Hàm lƣợng Nitơ formol Hàm lƣợng Protein Hoạt độ Protease Xác định đƣợc tỷ lệ VSV thích hợp
PLT sau khi thu mua về đƣợc rửa sạch và loại bỏ rác bẩn và PLT đƣợc xay nhỏ đến kích thƣớc 3÷5 mm. Mỗi mẫu thí nghiệm gồm 100 g PLT đã xay nhỏ và 5,2 g bột sắn thô (Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Luyến, 2006) [27], bổ sung thêm nƣớc với tỷ lệ 1:1 (v/w). Hỗn hợp này đƣợc cho vào bình tam giác 250 ml trộn đều và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. 6% dịch tăng sinh của hai chủng VK B. subtilis C10 và
L. fermentum TC10 với mật độ sinh khối ban đầu là 106 CFU/ml đƣợc cho vào hỗn hợp PLT đã tiệt trùng và để nguội đến nhiệt độ phòng. Tỷ lệ giữa dịch sinh khối của B. subtilis
C10 và L. fermentum TC10 đƣợc bố trí là 1:1, 1:2, 2:1. Mẫu thí nghiệm đối chứng (ĐC) không bổ sung VK cũng đƣợc thực hiện đồng thời. Các mẫu thí nghiệm đƣợc lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ 35o
C trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian lên men, phần dịch lỏng của các mẫu thí nghiệm đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc và loại bỏ phần bã chitin. Phần dịch lỏng đƣợc dùng để xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Tỷ lệ bổ sung VK thích hợp khi các giá trị của các chỉ tiêu là cao nhất.
2.3.4.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.2 (TN2).
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ VK thích hợp để bổ sung vào PLT, các thí nghiệm xác định nhiệt độ lên men thích hợp đƣợc tiến hành. Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị nhƣ trên, sau khi hấp tiệt trùng và làm nguội, môi trƣờng đƣợc bổ sung 6% sinh khối của hai chủng VK B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với mật độ ban đầu là 106 CFU/ml theo tỷ lệ thích hợp đã đƣợc khảo sát ở TN1. Các mẫu thí nghiệm đƣợc lên men ở các mức nhiệt độ (30oC, 35oC, 40oC, 45oC) trong 48 giờ. Sau thời gian lên men, dịch lỏng đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc. Phần dịch lỏng đƣợc xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Nhiệt độ lên men thích hợp khi các giá trị của các chỉ tiêu là cao nhất.
2.3.4.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.3 (TN3). Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ lên men thích hợp, các thí nghiệm khảo sát thời gian lên men đƣợc thực hiện. Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ trên, sau khi hấp và làm nguội, tiến hành bổ sung 6% sinh khối của hai chủng VK B. subtilis C10 và L. fermentum
TC10 với mật độ ban đầu là 106 CFU/ml theo tỷ lệ thích hợp đã đƣợc khảo sát ở TN1. Tiến hành lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát ở TN2 với các mức thời gian (8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 và 72 giờ). Sau từng mức thời gian lên men, dịch lỏng đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc. Phần dịch lỏng đƣợc xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Thời gian lên men thích hợp khi các chỉ tiêu phân tích có giá trị là cao nhất.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
2.3.4.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến chất lượng của chế phẩm probiotic
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein với chất mang đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở hình 2.4.
Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ VSV B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 bổ sung vào PLT, xác định đƣợc nhiệt độ và thời gian lên men PLT thích hợp để chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein có chất lƣợng tốt nhất (TN1, TN2, TN3), dịch carotenoprotein đƣợc phối trộn với chất mang bã sắn khô để tạo thành chế phẩm probiotic