3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.2.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo cấy ban đầu
đầu vào PLT đến hoạt độ enzyme protease
Thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp protease của VK, dịch thủy phân PLT chứa nhiều đạm (0,9%) (Nguyễn Minh Trí và cs, 2009), do vậy có thể sử dụng PLT làm môi trƣờng để VK thủy phân và lên men [32]. Trong điều kiện có mặt nguồn carbohydrate (bột sắn), VK lactic sẽ lên men carbohydrate tạo thành axit lactic và sinh tổng hợp enzyme protease. Axit lactic sẽ tác dụng với canxicacbonat trong vỏ tôm để tạo thành lactatcanxi ở dạng không hòa tan (Nguyễn Đức Lƣợng, 2001) [9]. Đồng thời hệ enzyme protease sẽ thủy phân một phần protein có trong PLT làm tăng quá trình khử protein khỏi chúng. Vì vậy việc sử dụng VK lactic trong quá trình lên men khử protein và tách chiết astaxanthin trên PLT sẽ nâng cao hiệu quả thu hồi chế phẩm carotenoprotein và hạn chế ô nhiễm môi trƣờng.
Lợi dụng hệ enzyme ngoại bào đa dạng của VK B. subtilis TC10 để thủy phân PLT giúp chuyển hóa các chất khó tiêu (protein) thành chất dễ tiêu (axit amin). Bên cạnh đó, B. subtilis và L. fermentum mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng chống lại các VK gây bệnh (Manha và cs, 2016) [89]. Mặt khác, các chủng này còn đƣợc công bố là có tác dụng làm tăng khả năng miễn dịch, khả năng kháng khuẩn và giúp vật nuôi tăng trƣởng nhanh (Strompfova và cs, 2005, Zhao và cs, 2012) [116],[126].
Sinh khối B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 2:1 đƣợc cho vào môi trƣờng PLT có bổ sung 5,2% bột sắn thô đã hấp tiệt trùng. Mật độ tế bào gieo cấy ban đầu là 106 CFU/g. Hỗn hợp đƣợc lên men ở nhiệt độ 35oC, trong 48 giờ. Sau thời gian lên men, dịch lỏng thu đƣợc sau khi tách bã đƣợc xác định hoạt độ protease bằng phƣơng pháp Ason cải tiến. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt độ protease
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Kết quả trên biểu đồ hình 3.1 cho thấy có sự khác nhau về hoạt độ protease trong môi trƣờng nuôi cấy khi thay đổi tỷ lệ gieo cấy ban đầu giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10. So với mẫu ĐC, hoạt độ protease thể hiện rất lớn khi bổ sung ở các tỷ lệ khác nhau. Hoạt độ này đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1:2. Hoạt độ trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại trong trƣờng hợp này là 46,81 UI/ml.
Ở tỷ lệ gieo cấy ban đầu giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 là 1:1 hoạt độ protease đạt đƣợc là 40,12 UI/ml và 37,8 UI/ml ở tỷ lệ 2:1. Kết quả phân tích thống kê cho thấy, hoạt độ protease đạt đƣợc ở các tỷ lệ gieo cấy ban đầu của hai chủng này là 1:1 và 2:1 không có sự sai khác khi xử lý thống kê với mức ý nghĩa p>0,05. Tất cả các thí nghiệm với các tỷ lệ gieo cấy ban đầu của hai chủng VK khác nhau đều cho giá trị hoạt độ protease trong môi trƣờng sau khi lên men lớn hơn rất nhiều so với mẫu ĐC. Trong đó, hoạt độ protease của mẫu có tỷ lệ 1:2 lớn hơn 88% so với mẫu ĐC. Các mẫu có tỷ lệ 1:1 và 2:1 lần lƣợt lớn hơn mẫu ĐC là 86,03% và 85,18%.
Kết quả này cho thấy có sự hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình phát triển của hai loài VK này. Ở các tỷ lệ 1:1 và 2:1, có lẽ do lƣợng tế bào của L. fermentum TC10 chƣa
đủ để tạo ra lƣợng axit lactic nhằm tạo môi trƣờng thích hợp cho quá trình phát triển của B. subtilis C10. Bên cạnh đó, trong quá trình phát triển của L. fermentum TC10, chủng này còn có thể tiết ra môi trƣờng một số chất dinh dƣỡng nhƣ một số vitamin (thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, vitamin B12 …), các amino acid tự do, các axit béo mạch ngắn. (Lee và Salminen, 2009, Parvez1 và cs, 2006)[81],[103].
3.2.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống
Sau 48 giờ lên men, ở 35oC mật độ tế bào sống của dịch lỏng thu đƣợc sau khi lọc tách bã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc (phƣơng pháp Koch). Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến mật độ tế bào sống
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Kết quả trên đồ thị hình 3.2 cho thấy, hai chủng B. subtilis C10 và L. Fermentum TC10 phát triển tốt trong môi trƣờng PLT phù hợp với kết quả đã công bố (Đỗ Thị Bích Thủy, 2008) [24]. Mật độ tế bào sống đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1:2. Mật độ tế bào sống trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại trong trƣờng hợp này là 9,68 lg CFU/ml. Mật độ tế bào sống này lớn hơn so với mẫu thí nghiệm có tỷ lệ 1:1 (9,53 lg CFU/ml) và 2:1 (9,57 lg CFU/ml) (p<0,05).
Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về mật độ tế bào sống trong các tỷ lệ gieo cấy khác nhau có lẽ liên quan đến sự phát triển của cả hai chủng VK này trong môi trƣờng. Với tỷ lệ 1:2, do mật độ của L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu cao nên tạo
ra các chất dinh dƣỡng đủ để B. subtilis C10 phát triển. Đồng thời, khi B. subtilis phát triển đến một mức độ nhất định sẽ làm kiềm hóa môi trƣờng do đó nó sẽ trung hòa với axit lactic làm cân bằng pH. Sự có mặt của B. subtilis C10 với một mật độ thích hợp sẽ tạo ra giá trị pH môi trƣờng thích hợp cho L. fermentum TC10 phát triển.
3.2.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch lỏng chứa sinh khối B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 2:1 trong môi trƣờng PLT có bổ sung 5,2% bột sắn thô sau 48 giờ lên men đƣợc xác định bằng phƣơng pháp DPPH. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hoạt tính kháng oxy hóa
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Dữ liệu hình 3.3 cho thấy có sự khác nhau về hoạt tính kháng oxy hóa ở các tỷ lệ khác nhau. Hoạt tính kháng oxy hóa này đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1:2. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch lỏng trong điều kiện này là 40,58%. Hoạt tính kháng oxy hóa thấp hơn ở các tỷ lệ còn lại. Cụ thể, hoạt tính kháng oxy hóa của dịch lỏng thu đƣợc sau khi lên men với tỷ lệ B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 ở 1:1 đạt 26,90%; tiếp đến là tỷ lệ 2:1.
Tất cả các thí nghiệm với các tỷ lệ gieo cấy ban đầu của hai chủng VK khác nhau đều cho giá trị hoạt tính kháng oxy hóa trong môi trƣờng sau khi lên men đều lớn
hơn rất nhiều so với mẫu ĐC. Trong đó, hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu có tỷ lệ 1:2 lớn hơn 70,84% so với mẫu ĐC. Các mẫu có tỷ lệ 1:1 và 2:1 lần lƣợt lớn hơn mẫu ĐC là 56,02% và 50,41%. Hoạt tính kháng oxy hóa ở các tỷ lệ 1:1, 2:1 là không có khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê.
Tỷ lệ VK bổ sung phù hợp giúp protein đƣợc phân cắt làm thay đổi đáng kể trình tự các mạch peptit và mức độ hình thành các acid amin (Liu và cs, 2013) [86], ảnh hƣởng quan trọng đến khả năng chống oxy hóa bởi vì hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc rất lớn vào trình tự và thành phần acid amin đƣợc hình thành từ quá trình thủy phân (Moure và cs, 2006) [96].
3.2.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu đầu vào PLT đến hàm lƣợng protein tách đƣợc so với ban đầu
Dịch lỏng thu đƣợc sau 48 giờ lên men đƣợc xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Kjeldahl. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lượng protein tách được so với ban đầu
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Hiệu quả tách chiết protein bởi các chủng B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với tỷ lệ khác nhau so với môi trƣờng đối chứng đạt đƣợc rất cao. Hàm lƣợng protein tách chiết đƣợc trong môi trƣờng có chứa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 đạt cao nhất ở tỷ lệ 1:2. Lƣợng protein trong dịch lỏng này đƣợc xác định khoảng 72,42%. Ở tỷ lệ 1:1 và 2:1 hàm lƣợng protein tách đƣợc lần lƣợt là 55,05% và 62%. Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hàm lƣợng protein tách đƣợc từ dịch lỏng thu đƣợc sau khi lên men trong môi trƣờng chứa PLT bởi các tỷ lệ giữa B.
subtilis C10 và L. fermentum TC10 khác nhau so với môi trƣờng không bổ sung các chủng VK này (p<0,05).
Sự khác biệt về hàm lƣợng protein tách ra đƣợc có thể lý giải, khi bổ sung một lƣợng VSV thích hợp vào môi trƣờng PLT thì sản sinh ra các enzyme ngoại bào, đặc biệt là enzyme protease để thủy phân protein của PLT tạo thành các peptid mạch ngắn, các axit amin hòa tan vào dịch lên men. Còn axit lactic sẽ phản ứng với CaCO3 tạo thành lactatcanxi ở dạng không hòa tan (Rao và cs, 2001 và 2005) [105],[106]. Ngoài ra, axit lactic sinh ra cũng có tác dụng làm mềm protein, hoạt hoá protein và thúc đẩy quá trình thuỷ phân, tạo điều kiện cho một số protease hoạt động (Trần Thị Luyến, 1998; Rao và cs, 2005) [11],[105]. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Hoài và Phạm Viết Nam (2017) khi nghiên cứu kết hợp ủ xilô với axit lactic trong quy trình sản xuất chitin từ PLT, hiệu suất khử protein đạt khoảng 78% [5].
Kết quả này phù hợp với kết quả phần 3.2.1. Kết quả của phần 3.2.1 cho thấy hoạt độ protease cao nhất ở mẫu thí nghiệm có tỷ lệ 1:2 dẫn đến hoạt động thủy phân và giải phóng protein ra khỏi phần vỏ chitin. Vì thế, lƣợng protein thu đƣợc trong dịch chiết cũng tăng lên tƣơng ứng.
3.2.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol đầu vào PLT đến hàm lƣợng nitơ formol
Sinh khối B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với các tỷ lệ 1:1, 1:2 và 2:1 đƣợc cho vào môi trƣờng PLT có bổ sung 5,2% bột sắn thô đã hấp tiệt trùng. Hỗn hợp đƣợc lên men ở nhiệt độ 35oC, trong 48 giờ. Sau thời gian lên men, dịch lỏng thu đƣợc sau khi tách bã đƣợc xác định hàm lƣợng nitơ formol bằng phƣơng pháp Sorensen. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến hàm lượng nitơ formol
(Số liệu có các chữ cái a, b, c biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình với p<0,05)
Kết quả trên đồ thị hình 3.5 cho thấy khi thay đổi tỷ lệ gieo cấy ban đầu giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 đã có sự khác nhau về hàm lƣợng nitơ formol trong dịch chiết. Hàm lƣợng này đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ 1:2 là 1,31 g/l (kết quả trung bình của 3 lần lặp). Ở mẫu thí nghiệm với tỷ lệ 1:2 cho kết quả hoạt độ protease cao nhất (kết quả phần 3.2.1), vì vậy, lƣợng amino acid tự do cũng đạt cao nhất. Có nghĩa là protease đƣợc sinh tổng hợp có khả năng hoạt động tốt trong môi trƣờng này. Lƣợng nitơ formol thu đƣợc ở các tỷ lệ B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 1:1 và 2:1 thấp và không có sự sai khác khi xử lý thống kê (p<0,05) (Hình 3.5).
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên (Hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5) cho thấy có sự khác nhau về tỷ lệ gieo cấy của hai chủng VK. Mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ enzyme ngoại bào protease, hàm lƣợng protein và amino acid đều đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ (1:2). Qua các kết quả nghiên cứu tỷ lệ giữa hai chủng B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT, chúng tôi đã xác định đƣợc tỷ lệ gieo cấy thích hợp nhất của hai chủng B. subtilis C10 và L. fermentum
TC10 là (1:2) để thực hiện thí nghiệm tiếp theo.