3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu
2.3.4.1. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ giữa B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 gieo cấy ban đầu vào PLT đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.1 (TN1).
Bã chitin Làm nguội (nhiệt độ phòng)
Lên men PLT ở 35oC trong 48 giờ
Lọc loại bỏ bã Dịch carotenoprotein Phế liệu tôm (100g) Hấp tiệt trùng (121oC, 20 phút) Bột sắn (5,2g) Phối trộn Xay nhỏ (3-5mm) B. subtilis C10 Phối trộn theo các tỷ lệ (1:1, 1:2, 2:1 và ĐC) L. fermentum TC10 Nƣớc (100ml) Phân tích các chỉ tiêu Mật độ tế bào sống Kháng oxy hóa Hàm lƣợng Nitơ formol Hàm lƣợng Protein Hoạt độ Protease Xác định đƣợc tỷ lệ VSV thích hợp
PLT sau khi thu mua về đƣợc rửa sạch và loại bỏ rác bẩn và PLT đƣợc xay nhỏ đến kích thƣớc 3÷5 mm. Mỗi mẫu thí nghiệm gồm 100 g PLT đã xay nhỏ và 5,2 g bột sắn thô (Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Luyến, 2006) [27], bổ sung thêm nƣớc với tỷ lệ 1:1 (v/w). Hỗn hợp này đƣợc cho vào bình tam giác 250 ml trộn đều và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. 6% dịch tăng sinh của hai chủng VK B. subtilis C10 và
L. fermentum TC10 với mật độ sinh khối ban đầu là 106 CFU/ml đƣợc cho vào hỗn hợp PLT đã tiệt trùng và để nguội đến nhiệt độ phòng. Tỷ lệ giữa dịch sinh khối của B. subtilis
C10 và L. fermentum TC10 đƣợc bố trí là 1:1, 1:2, 2:1. Mẫu thí nghiệm đối chứng (ĐC) không bổ sung VK cũng đƣợc thực hiện đồng thời. Các mẫu thí nghiệm đƣợc lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ 35o
C trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian lên men, phần dịch lỏng của các mẫu thí nghiệm đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc và loại bỏ phần bã chitin. Phần dịch lỏng đƣợc dùng để xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Tỷ lệ bổ sung VK thích hợp khi các giá trị của các chỉ tiêu là cao nhất.
2.3.4.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.2 (TN2).
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ VK thích hợp để bổ sung vào PLT, các thí nghiệm xác định nhiệt độ lên men thích hợp đƣợc tiến hành. Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị nhƣ trên, sau khi hấp tiệt trùng và làm nguội, môi trƣờng đƣợc bổ sung 6% sinh khối của hai chủng VK B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 với mật độ ban đầu là 106 CFU/ml theo tỷ lệ thích hợp đã đƣợc khảo sát ở TN1. Các mẫu thí nghiệm đƣợc lên men ở các mức nhiệt độ (30oC, 35oC, 40oC, 45oC) trong 48 giờ. Sau thời gian lên men, dịch lỏng đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc. Phần dịch lỏng đƣợc xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Nhiệt độ lên men thích hợp khi các giá trị của các chỉ tiêu là cao nhất.
2.3.4.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lên men đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình 2.3 (TN3). Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ lên men thích hợp, các thí nghiệm khảo sát thời gian lên men đƣợc thực hiện. Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ trên, sau khi hấp và làm nguội, tiến hành bổ sung 6% sinh khối của hai chủng VK B. subtilis C10 và L. fermentum
TC10 với mật độ ban đầu là 106 CFU/ml theo tỷ lệ thích hợp đã đƣợc khảo sát ở TN1. Tiến hành lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp đã khảo sát ở TN2 với các mức thời gian (8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64 và 72 giờ). Sau từng mức thời gian lên men, dịch lỏng đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua vải lọc. Phần dịch lỏng đƣợc xác định các chỉ tiêu (mật độ tế bào sống, hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt độ protease, hàm lƣợng protein và nitơ formol). Thời gian lên men thích hợp khi các chỉ tiêu phân tích có giá trị là cao nhất.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến chất lượng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein
2.3.4.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein vào chất mang đến chất lượng của chế phẩm probiotic
Quy trình bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ phối trộn dịch carotenoprotein với chất mang đến chất lƣợng của chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein đƣợc thể hiện ở hình 2.4.
Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ VSV B. subtilis C10 và L. fermentum TC10 bổ sung vào PLT, xác định đƣợc nhiệt độ và thời gian lên men PLT thích hợp để chế phẩm probiotic giàu carotenoprotein có chất lƣợng tốt nhất (TN1, TN2, TN3), dịch carotenoprotein đƣợc phối trộn với chất mang bã sắn khô để tạo thành chế phẩm probiotic sử dụng trong chăn nuôi. Bã sắn khô đƣợc hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Tiến hành phối trộn dịch carotenoprotein với bã sắn khô theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4. Chế phẩm sau khi phối trộn đƣợc sấy nhẹ ở nhiệt độ 35oC trong thời gian 5 giờ. Sau đó, chế phẩm đƣợc xác định các chỉ tiêu mật độ tế bào, hàm lƣợng astaxanthin và xác định độ ẩm của chế phẩm. Tỷ lệ phối trộn thích hợp khi mật độ tế bào sống, hoạt độ protease và hàm lƣợng astaxanthin là cao nhất.