Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

6. Bố cục của luận án

1.2.3. Tổng quan về phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

1.2.3.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào ung thư

Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phương pháp thử nghiệm xác định tính độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp và đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch [29] [30].

a. Xác định khả năng gây độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào

nuôi cấy dạng đơn lớp

Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào ung thư cytotoxic assay đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp là phương pháp dạng SRB. Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [29].

b. Xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch

Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch là phương pháp dạng MTT. Phương pháp này được thực hiện tương tự theo phương pháp của Mosmann Bernardes và cộng sự vào năm 1983 Nhóm tác giả sử dụng muối tetrazolium MTT-(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong ph p so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Như vậy, càng nhiều formazan thì tỷ lệ tế bào sống sót càng cao [30].

1.2.3.2. Xác định khả năng ức chế đại thực bào sản sinh NO

Việc sản xuất NO sinh lý là cực kỳ quan trọng để bảo vệ cơ thể, tuy nhiên, sản xuất quá mức và các chất chuyển hóa của nó có liên quan đến sự phát triển của các bệnh lý, ch ng hạn như sốc nhiễm trùng do vi khuẩn và viêm mãn tính. Phương pháp khảo sát khả năng ức chế tế bào đại thực bào sinh NO là phương pháp được sử dung phổ biến trong việc thăm dò hoạt tính kháng viêm đối với các loại thực vật nhằm đánh giá tác nhân ngăn chặn sản xuất có thể có lợi cho việc điều trị phản ứng viêm. Ngoài

ra, các loài gốc tự do cũng chịu trách nhiệm kích hoạt một số yếu tố phiên mã tiền viêm, có liên quan đến việc thúc đẩy các bệnh viêm [31].

Đến thời điểm nghiên cứu, chưa có công bố nào về khả năng kháng viêm trên đối tượng dịch chiết rễ cây mật nhân, do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, khảo sát khả năng này nhằm tìm ra đặc tính mới, bổ sung giá trị cho nguyên liệu đã lựa chọn nghiên cứu.

1.2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase

Chứng tăng đường huyết sau khi ăn dẫn đến sự tiến triển của bệnh tiểu đường tu p 2, do đó phương pháp ức chế hoạt động của enzyme -glucosidase trong điều trị tiểu đường tu p 2 là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay.

Khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase qua đó đánh giá được khả năng kháng bệnh đái tháo đường tuýp 2 của dịch chiết nước. Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-nitrophenyl--D-glucopyranoside nhờ tác động của enzyme  - glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme  - glucosidase [32].

1.2.3.4. Xác định hoạt tính kháng viêm thông qua khảo sát cytokine tiền viêm và

cytokine gây viêm

Viêm là một cơ chế bảo vệ do các yếu tố hóa học khác nhau gây ra, và bao gồm các thay đổi phức tạp, tuần tự để loại bỏ nguyên nhân ban đầu, nhiều bệnh được theo sau bởi các quá trình viêm cấp tính hoặc mãn tính với sản xuất nhiều chất trung gian hóa học, ch ng hạn như xơ vữa động mạch, bệnh Alzheimer, ung thư, hen suyễn và các bệnh nhiễm tr ng, như bệnh lao [31].

Cytokine là các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất và phóng thích bởi các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác không phải bạch cầu. Các protein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào trong cơ thể, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh l cũng như sinh l bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm. Tuy nhiên các phân tử này cũng đóng vai trò khá quan trọng trong các bệnh l như: Bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư.

Cytokine tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm điều chỉnh các phản ứng miễn dịch và viêm. Các phân tử hiệu ứng này được tạo ra tạm thời và cục bộ kiểm soát biên độ và thời gian của phản ứng Phương pháp xác định hàm lượng cytokine tiền viêm và cytokine gây viêm giúp đánh giá khả năng kháng viêm của tế bào vì nếu quá trình sản xuất quá nhiều hoặc không đủ cytokine có thể góp phần đáng kể vào sinh lý bệnh của một loạt bệnh tự miễn dịch, các bệnh truyền nhiễm và đào thải khi ghép tạng (ví dụ, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-alpha) [33].

1.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng tương tự phương pháp nghiên cứu của Hadacek và cộng sự vào năm 2000 [34].

Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm kiểm định nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC Minimum inhibitor concentration - nồng độ tối thiểu ức chế), IC50

(50 % inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50% , MBC Minimum bactericidal

concentration - nồng độ tối thiểu diệt khuẩn Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm

những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người như:

- Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram + , sinh bào tử, thường không gây bệnh

- Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram + , gây mủ các vết thương, vết

bỏng, gây viêm họng, nhiễm tr ng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram + , vi khuẩn đường ruột lên men có

ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật

- Escherichia coli là vi khuẩn Gram (- , gây một số bệnh về đường tiêu hoá như

viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm l trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram (- , trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm

tr ng huyết, các nhiễm tr ng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enterica là vi khuẩn Gram - , vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm

tr ng đường ruột ở người và động vật

-Candida albicans là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh

Môi trường nuôi cấy: MHB Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar cho vi khuẩn; SDB

(Sabouraud – 2 % dextrose broth) và SA (Sabouraud – 4 % dextrose agar cho nấm.

Chất tham khảo:

- Kháng sinh ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram +

- Kháng sinh cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram -)

- Kháng nấm nystatin cho chủng nấm

Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN:

2. ( ) (%) 100 ( ) ( ) ODtest ODcontrol IC x ODcontrol ODcontrol      

Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

1.2.3.6. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa thường được sử dụng như sau:

a. Phương pháp thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do. Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm – 517 nm [35]. Phương pháp này thực hiện nhanh chóng, đơn giản, chính xác và có thể đo hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất khác nhau.

b. Phương pháp dựa vào năng lượng khử

Năng lực khử được xác định tương tự theo các phương pháp được sử dụng của nhóm nghiên cứu Oyaizu và cộng sự năm 1986, nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuân Duy và cộng sự năm 2013. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp khử kali ferricyanide để xác định quá trình khử, phản ứng chuyển hóa Fe3+

thành Fe2+. Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết được trộn với đệm phosphate pH = 6,6 để đạt thể tích cuối c ng 1,5 mL trước khi thêm 0,5 mL K3(Fe[CN3 1 % Hỗn hợp được ủ ở 50 oC trong 20 phút, sau

đó thêm 0,5 mL TCA 10 % và 2 mL nước cất, cuối c ng 0,4 mL AlCl3 0,1 % được thêm vào Độ hấp thu quang học được xác định tại bước sóng 700 nm Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh Tính toán giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50 [36] [37].

c. Phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa trên mô hình dầu - nước

Hệ nhũ tương dầu - nước được chuẩn bị gồm: 10 % dầu Olive, 85 % nước và 0,5 % Tween 40 Hỗn hợp được đồng hóa ở tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút Lấy chính xác 2 mL dịch chiết được trộn đều với 10 mL hệ nhũ tương dầu – nước chứa trong ống nhựa 50 mL có nắp đậy, được đặt trong tủ ổn nhiệt ở 50 oC, quá trình oxy hoá chất b o được quan sát hàng ngày Hàm lượng hydroperoxide được xác định trên dịch chiết chất b o theo phương pháp của Bligh and Dyer vào năm 1959 Hàm lượng hydroperoxide được xác định theo phương pháp của Richards và Hultin vào năm 2002 Kết quả tính toán hàm lượng hydroperoxide từ đường chuẩn Cumene hydroperoxide (HPO) nồng độ từ 0-120 nmol/mL [36] [38] [39].

Ngoài ra, có một số phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa khác [35]:

- Phương pháp TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity : Xác định hoạt

tính kháng oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox

- Phương pháp ORAC oxygen radical absorbance capacity : Xác định khả năng

hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động

- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential : Khả năng

kháng oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP ferric reducing-antioxidant power : Lực kháng oxy hóa

bằng phương pháp khử sắt

- Phương pháp Conjugated Diene: Khảo sát nối đôi liên hợp

Các phương pháp trên có tính đặc hiệu cao, tuy nhiên, phương pháp phức tạp, khó thực hiện, các hóa chất sử dụng đắt tiền, khó cung cấp, đồng thời phòng thí nghiệm không được trang bị đầy đủ các thiết bị phục vụ phân tích.

1.2.3.7. Phương pháp thử độc tính

Thử độc tính để biết được nguy cơ gây tác động xấu đến sức khỏe con người khi tiếp xúc, ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như các sinh vật nơi sử dụng các sản phẩm. Giúp thiết lập liều lượng trong thử nghiệm lâm sàng để cung cấp thông tin ban

đầu về mẫu thử nghiệm Các phương pháp được sử dụng phổ biến đối với nghiên cứu trên đối tượng thảo dược như sau:

- Thử độc tính bất thường: Độc tính bất thường hay còn gọi là độc tính cấp là

biểu thị sự tác động xấu hay sự tử vong của sinh vật ngay sau khi tiếp xúc với chất độc Độc tính cấp xảy ra do tiếp xúc với đơn hoặc đa yếu tố trong một thời gian ngắn và tác động cấp tính là tác động xảy ra trong vòng một vài ngày hoặc thậm chí là một vài giờ đầu tiên sau khi tiếp xúc với chất độc, thông thường thời gian gây độc cấp tính phải ít hơn hai tuần Mặt khác, vì những tác động mãn tính chỉ xuất hiện sau khi tiếp xúc lặp lại với một chất độc, trong nhiều trường hợp cần phải tiếp xúc liên tục hàng tháng Trong khi đó, tác nhân gây độc tính cấp được hấp thụ nhanh chóng vào cơ thể và sản sinh ra ngay lập tức các hiệu ứng độc cho cơ thể, song cũng có trường hợp, tiếp xúc cấp tính bị suy giảm độc tính Thử độc tính bất thường là một phương pháp để xác định tiêu chuẩn của một dạng thuốc nào đó Đó là tiêu chuẩn về độ an toàn của thuốc Trong thử độc tính bất thường quy định rõ: Động vật thử là gì, tình trạng con vật, cân nặng động vật, số con, liều thử, đường d ng, thời gian theo dõi, không có biểu hiện bệnh l và phải không có con vật nào chết Mục đích: Cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo [40] [41].

- Thử độc tính bán trường diễn: Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi

đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi d ng mẫu thử nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi d ng dài ngày, bao gồm:

 Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

 Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu có [40].

Quy trình thử độc tính bất thường được thực hiện theo hướng dẫn tại phụ lục 13.5 – Dược điển Việt Nam.

1.2.3.8. Phương pháp xác định khả năng không gây độc đối với tế bào người

đưa ra thành phẩm là một quá trình phức tạp có thể mất 12 ÷ 15 năm và tốn kém. Ý tưởng cho một mục tiêu có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm nghiên cứu học thuật và lâm sàng và từ lĩnh vực thương mại. Xây dựng cơ sở bằng chứng hỗ trợ trước khi chọn mục tiêu cho một chương trình khám phá có thể mất nhiều năm Khi đã chọn được mục tiêu, ngành công nghiệp dược phẩm và gần đây là một số trung tâm học thuật đã đưa ra một số quy trình ban đầu để xác định các phân tử có các đặc tính phù hợp để tạo ra các loại sản phẩm được chấp nhận Đánh giá này sẽ xác định mục tiêu ban đầu, thông qua phát triển thử nghiệm, sàng lọc thông lượng cao, tối ưu hóa và cuối